用桂花变种研究了乙酰丁香酮（AS）的添加方法，共培养物的浓度和pH值对桂花遗传转化的影响。果表明，在接种物和共培养液中添加AS可以显着提高桂花抗性芽的诱导率，
桂花树价格最适浓度为100μmol。1。
培养液的pH值也影响了桂花抗性芽的诱导率，其中桂花的转化率在pH 5共培养液中最高。2。究结果优化了桂花遗传转化体系，提高了桂花的转化效率，为促进桂花转基因工作奠定了坚实的基础。花（Cucumis sativus L.）是一种重要的经济作物，在世界范围内拥有较大的种植面积。花的遗传基础狭窄，种质资源少，许多重要的遗传性状不能通过性杂交来改良。果，基因工程技术已成为常规育种的有效补充。杆菌介导的子叶节方法是转基因桂花的最常用方法[1]。前，诸如iaaM [2]，BnCS [3]和opd [4]等基因已被转移至桂花。是，该方法的最大瓶颈是桂花再生困难，加工效率低。此，如何提高桂花的转化率，建立稳定高效的转化体系是桂花遗传转化的迫切问题。酰丁香酮（AS）是宿主细胞分泌的一种酚类化合物，可通过改善农杆菌的感染效果来提高基因转化的效率。前，一定浓度的AS被添加到转化各种农作物例如水稻[5]，辣椒[6]和杨树[7]的基因的过程中，以提高加工效率。SA的效果受多种因素影响，例如植物种类，添加SA的方法和浓度，菌株和载体类型，共培养的pH值以及具有对SA的协同作用[8]。中，添加方法和AS的浓度以及共培养的pH是三个更重要的因素。索这三个因素对桂花转化率的影响，对于优化桂花遗传转化体系具有重要意义。告。本文中，桂花桂皮。长春为试验材料，研究了AS添加方法，共培养物浓度和pH对桂花遗传转化效率的影响，以阐明条件和条件。
花遗传转化过程中使用AS的方法及最佳方法。pH值的共培养和建立稳定高效的桂花遗传转化体系将为提高桂花转化效率和促进桂花转基因工作奠定坚实的基础。花。物材料一种来自中国北方的长春桂花的近交系，在南京农业大学葫芦科遗传与遗传创新实验室中高度保存。株和质粒所用农杆菌菌株为EHA105（Rif R，Kan R），由我们的实验室储存和提供。
物表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3是由我们的实验室构建的。载体带有HYG（潮霉素）标记基因，CsCBF3靶基因[9]，GUS基因，GFP基因，CaMV35S启动子和NOS终止子。图如图1所示。2012年3月，在南京农业大学对桂花进行了农杆菌-子叶节点转化实验。择固体长春种子，对其进行消毒，并在0.1％的汞溶液中灭菌8分钟，用无菌水冲洗4-6次，用滤纸轻擦，然后将它们播种在MS培养基上。（25±2）°C暗培养2天，然后转移到光下继续培养.4-5天后，将子叶节切开并接种在预培养基中2天黑暗。除携带表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3的农杆菌EHA105的单个菌落，并将其接种到液体培养基YEB + 50mg·L-1 Kan + 50mg·L-1 Rif中，并摇至28℃ 16小时离心后，弃去上清液，
桂花树价格加入MSO液体培养基，并以OD600为0.6重悬作为感染溶液。预先培养的桂花的子叶节用细菌MS0农杆菌溶液感染10分钟。干细菌溶液后，将其接种在共培养基上。暗培养3天后，将其转移到选择培养基中，每2周移植一次。1次乙酰丁香酮处理1）将乙酰丁香酮添加到传染性细菌溶液中：将乙酰丁香酮添加到农杆菌MS0细菌溶液中，使最终浓度为0、50、100、150、200μmolL-1 ，并低速摇动孵育1小时以激活土壤杆菌，然后将其用作感染的感染液，重复每次处理3次。
2）在共培养液中加入乙酰丁香酮：本实验采用双向正交设计，将共培养液的pH值设置为4.9、5.2、5.5、5.8并在每个pH值下以最终浓度添加乙酰丁香酮。其为0、50、100、150、200μmol·L-1，将不含AS的农杆菌MS0溶液用作感染溶液，并重复各处理3次。计和数据分析将抗性芽在选择培养基上继代培养，并在2至3次继代培养（选择性培养30天）后计算长芽的外植体和总外植体的数量。性芽诱导率（表示为产生抗性的芽的外植体数与外植体总数之比的百分数）用作评估桂花转化率的指标。用SPSS 20.0软件计算平均值，标准偏差以及数据显着方差的分析。预培养2天的桂花子叶节浸入含有不同浓度乙酰丁香酮的细菌溶液中以对其进行感染。染后，将细胞在共培养基上培养3天，然后在选择培养基上接种30天。统计，抗性芽的诱导率。
果显示（表1），与对照相比，在感染的细菌溶液中添加AS可以显着提高对桂花抗性头的诱导率。着浓度的增加，抗性芽诱导率也增加，当浓度为100μmol·L-1时达到最高。果AS浓度继续增加，则诱导率将降低。表明在感染性细菌溶液中加入SA可以有效提高桂花的转化率，但浓度不要过高，以100μmol·L-1为最佳。[注意]大写字母表示差异显着（P <0.01），小写字母表示差异显着（P <0.05）。
以下相同。预先培养2天的桂花子叶节浸入细菌溶液中而不添加乙酰丁香酮，感染后，将其接种在具有不同AS和pH浓度的培养基中3天，然后转移至选择介质。30天后进行筛选培养，计数外植体总数和长芽外植体数量，并计算抗性芽诱导率（表2）。果表明，不同浓度的SA和不同的共培养pH值的组合对桂花抗性头的诱导率有显着影响。不同的组合中，在不添加pH 4.9或5.8的AS的共培养基上获得的抗性头的最低诱导率均为13.33％。pH 5.2的共培养液中添加100μmol·L-1AS的桂花芽诱导率最高，达到44％。
此，该组合可以用作桂花转化过程中最合适的共培养条件。表3所示，独特的乙酰丁香酮浓度因子的F值已经达到非常显着的水平，表明共培养阶段的AS浓度对诱导率具有很大的影响。对桂花具有抗性，因此本研究将其作为主要作用因子。析了它们对桂花转化率的影响。果显示（表4），与不添加AS的对照相比，向共培养基中添加AS可以显着提高对桂花抗性头的诱导率。本研究确定的AS浓度范围内，随着浓度的增加，抗桂花芽的诱导率也持续增加，并在100μmol·L的浓度达到峰值。-1，为38.05％。是，随着AS浓度持续增加，诱导速率反而降低，因为通常使用二甲基亚砜（DMSO）溶解AS，并且二甲基亚砜具有剧毒。
长。培养的pH水平也会影响农杆菌感染的效果。了探索桂花转化过程中的最佳共培养pH，将其作为主要影响因素进行了分析。计结果表明（表5），在不同共培养pH条件下获得的桂花抗性桂花的诱导率是不同的。pH为5.8时，桂花抗性头的诱导率最低，仅为22.59％。
pH 5.2时，桂花抗性头的诱导率最高，为31.65％，但与共培养物pH 5的诱导率没有显着差异。5。此，可以得出结论，pH为5.2至5.5的共培养基更适合于桂花的转化。酰丁香酮是一种酚类化合物，其主要作用机理是诱导农杆菌Vir区基因的激活和表达，并切割pb边缘序列的T-DNA区。T的两个侧面，可促进DNA的转移。进农杆菌T-DNA在植物基因组中的进入和整合[10]。
据乙酰丁香酮的作用机理，通常将其分为三种方法：添加至细菌溶液中，添加至共培养基中以及共添加细菌溶液与共培养基。-在使用过程中进行培养。土壤杆菌属溶液中加入100μmol·L-1的乙酰丁香酮可以将转化芽的诱导率从5.76％提高到12.1％[11]。调查杉木的转化过程中，添加80μmol·L-1乙酰丁香酮，抗Kan性芽的发生频率明显高于对照[12]。然，还有其他有效使用乙酰丁香酮的方法，例如将乙酰丁香酮滴在甘薯的外植体伤口上也可以显着提高抗性芽的发生率[13]。这项研究中，将一定浓度的乙酰丁香酮加入感染性细菌溶液和共培养基中，结果表明，与对照相比，两种方法均可以显着提高诱导率。桂花的抗性。遗传转化过程中，乙酰丁香酮的最佳浓度在一个物种之间变化。软木的遗传转化过程中，乙酰丁香酮的添加量最大为60μmol·L-1[14]，而在软木的共培养基中添加100μmol·L-1的乙酰丁香酮。日葵的遗传转化最有利于提高转化率[15]，而普通丹参培养基中乙酰丁香酮的最佳浓度为400μmol·L-1[16]。文研究了桂花中乙酰丁香酮的最佳浓度，发现添加100μmol·L-1乙酰丁香酮可以显着提高抗性芽的诱导率。花。pH值对乙酰丁香酮的诱导作用也有显着影响。论上，当含有乙酰丁香酮的培养基的pH为5.0-5.5时，乙酰丁香酮的诱导作用。酰丁香酮更好。前的研究表明[17]，乙酰丁香酮在pH 5.2时具有最佳的转化效果。究了pH值对桂花遗传转化的影响。验结果表明，在pH 5.2下共培养桂花的抗性芽诱导率最高，但对桂花抗性没有明显影响。花的诱导。文系统地研究了乙酰丁香酮在桂花遗传转化中的应用，进一步优化了桂花遗传转化体系，为遗传转化的发展奠定了坚实的基础。花。
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