[桂花树价格]实施多重DPOPCR检测桂花转基因MON810和MIR604系统

　　该基因插入位点的MIR604和桂花应变MON810转座序列，分别设计DPO菌株特异性引物的多重PCR DPO-桂花MON810和检测转基因事件MIR604的应变。果表明，设计DPO引物具有高特异性，灵敏度为0.5 ng / ul，对退火温度不敏感。试验的特异性高，灵敏度高，有利于转基因MON810和桂花MIR604快速检测菌株。2016年，全球转基因作物面积185.1万HM2，增长3％[1]年。着大量基因转移农产品的出现，转基因作物的安全性也不容忽视。国已颁布有效的法律法规，转基因标识制度和要求的规定。

　　
　　PCR是检测转基因的主要方法，但通量PCR和普通PCR较低。重PCR在反应体系中加入多个引物对可同时检测多个靶基因，不仅提高了产量，还降低了试验成本。

　　规多重PCR系统，引物退火温度，引物二聚体和其他错配之间的差异很可能导致灵敏度降低，非特异性扩增问题。
　　启动子寡核苷酸引物（双引发寡核苷酸，DPO）是一种设计PCR引物的新方法[2]。

　　理：引物与肌苷寡聚连接的6〜12个碱基，2支引物链段端部5末端序列次黄嘌呤（肌苷，I）更低的温度嘌呤“通过从18至25个碱基的序列和3”端退火，其允许寡核苷酸引物在退火过程中次黄嘌呤形成类似的囊泡结构，使得引物是双特异性独立的双引物结构。究表明，DPO引物“末端和3”末端的三个或更多个碱基的坏端存在，PCR反应不会大大增强特异性引物。技术为PCR引物设计提供了一种新的多重方法，并已广泛用于病原体的检测[3-7]。此，本研究旨在建立一种基于DPO多重PCR引物的方法，用于同时检测转基因菌株MIR604和桂花MON810。
　　基因MON89034桂花，转基因大豆GTS40-3-2，转基因油菜GT73转基因水稻TT51-1，非转基因桂花，样品存放在中国检验检疫科学研究院的。要设计。
　　成引物Sangon Biological Engineering Co.，Ltd。上海）的转基因MON810和MIR604 DPO引物插入序列的桂花（表1）。
　　DNA提取。取基因组DNA样品，测量浓度和纯度，根据试剂盒方法用核酸分析仪储存在-20℃储备蛋白中。重DPO-PCR系统。Takara反应体系的多重PCR试剂盒参考：每种引物的最终浓度为0.4 pmol / L，DNA模板为1.0μL，Mix 1为0.25μL，Mix 2溶液，25μL用ddH2O将体积调节至50μl反应体系。应条件：94℃变性5 min; 94℃30s变性，60℃退火60s，60℃延伸72℃，35个循环;延长10分钟72℃。PCR后，使用2.0％琼脂糖进行电泳。估特异性。
　　据1.2.3系统，转基因反应体系由轻度转基因osmant组成，转基因糖由甜转基因osmanterie组成，转基因基因由6个胶囊组成。TT51-1，非转基因基因组DNA桂花为模板，用于多重评估DPO-PCR反应体系的特异性。估灵敏度。
　　基因和桂花MON810基因组DNA MIR604校准浓度50.00毫微克/微升，然后稀释至5.000，0.500，0.050，0.005纳克/微升的浓度，1微升被作为模板用于扩增DPO-PCR多重，灵敏度评估。敏度测试退火温度。据反应系统1.2.3多DPO-PCR中，退火温度为50〜65℃，桂花树价格每个梯度5℃1梯度至4，DNA的转基因桂花MON810和作为温度MIR604基因组的混合物敏感模型试验的退火。1示出了建立和MON810 MIR604检测检测多重DPO-PCR的检测结果单线DPO-PCR，其为特定频带266 bp和127 bp的转基因多DPO-PCR桂花一致的结果的。
　　表2所示，转基因MON810和桂花MIR604阳性，而其他8个样品均为阴性和非靶标，特异性多重检测方法强烈建立DPO-PCR。2显示当DNA模板的含量为50，000，5，桂花树价格000，0，500 ng / pl 2时，可以扩增组条目，并显示连续减少，当模型含量为0，050 ng / ul或更低时减少，未能放大目标频段。3显示了DPO-多重PCR可以在50，55，60，65℃四个温度梯度退火扩增基因，DPO-多重PCR检测方法是不敏感的，以指示建立退火温度的。果表明，DPO引物设计的高特异性，0.500纳克/微升的灵敏度，以及退火温度不敏感，从而建立用于检测和转基因桂花MON810多个DPO-PCR法MIR604。
　　方法的特异性，高灵敏度，对退火温度不敏感，该样品适合于快速筛选这两种转基因食品系桂花，动物饲料等。
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