[桂花树价格]桂花根际球孢白僵菌遗传多样性的ISSR分析

　　为了阐明在根际樨遗传分化和亲缘关系白僵菌，从根际樨分离遗传多样性白僵菌通过ISSRPCR分子标记的技术的研究。40个引物中共筛选出11个具有高多态性和稳定性的引物进行正式扩增分析，37个菌株共扩增出83个条带，其中69条为多态性条带。态性百分比为83.13％。个引物的平均扩增条带为7.5。
　　态位点（PPL）的人口的百分比为83.13％，NEI基因的多样性指数0.316（H）和信息Shannon指数（I）0.465 7.结果表明，从安徽省Gu阳县，萧县县和蒙城县三个地区分离出的球孢白僵菌具有较高的遗传多样性。研究结果对进一步研究白僵菌不同菌株对生物防治的影响具有重要意义。僵菌作为重要的生物防治资源，球孢白僵菌可用于控制农业，林业和卫生等各种害虫，并取得了成功[13]。僵菌是白僵菌最着名的种类，它具有多种宿主，可以感染超过700种昆虫，包括15目和149科。是一种具有重要价值的昆虫病原真菌[47]。着分子生物学技术的飞速发展和新技术的出现，人们已经开始利用分子生物学研究技术，研究虫生香菇的遗传多样性，这抵销了形态变化强和与传统的分类方法相比，文化特征。些都提供了种株的遗传关系鉴定的可靠依据，有助于加强对虫生香菇的遗传多样性研究和释放菌株的检测和监控提供了可靠的依据。今为止，已经使用各种分子DNA标记技术来研究球孢白僵菌种群的遗传多样性。贵Ding等人[8]研究白僵菌人口的松林主机传递和遗传多样性在连续监测松毛虫通过同工酶estérase.Les结果的影响表明白僵菌是在松树林中暴露的。富的遗传多样性方志刚等[9]，林华峰等。[10]利用RAPD技术分析球孢白僵菌菌株的遗传分化，发现菌株之间存在丰富的遗传多态性，以及菌株与收集位点之间的DNA多态性。

　　一些相关性。明军等[11]研究了白僵菌菌株的遗传多样性与所述内含子rDNAI技术28结果表明，从相同的区域茎中丰富类型的干的一个给定的时间和人口的遗传结构是多样的。工。ISSR（ISSR）是一种新的分子标记，广泛用于真菌遗传多样性的研究[12]。技术广泛用于基于SSR的真核基因组。用通常存在于基因组中的SSR设计引物，以扩增SSR之间的序列。扩增的引物具有16到18个碱基的长度，并且通常为1由约4个碱基和几个非重复锚碱基A串联重复不需要预克隆或测序[1315]。比分子标记，如AFLP和RAPD，多态性是高，退火温度高，DNA的量是低的，并可以被检测到安全élevée.Le基因组DNA多态性快速，高效和灵敏度高，操作简单。低成本和高重现性使其成为检测物种遗传变异的理想分子标记[1617]。
　　Li等人[18]所用的ISSR分子标记技术来研究在不同高度，并在安装在大别安徽不同时期收集的遗传多样性白僵菌，发现白僵菌更安徽省大别山高。传多样性，其中种群间的遗传变异相对较低，并且种群具有较高水平的遗传分化。小磊等[19]使用的ISSR技术来分析遗传多样性和球孢白僵菌的南部Chine.Les结果人口的遗传结构表明，球孢白僵菌的遗传多样性较大和的异质人口更强大。究表明，球孢白僵菌广泛分布于不同的生态环境中，包括根际和植物组织[2021]。花是安徽重要的粮食和饲料，经常在生长过程中通过土壤传播的地下病虫害的威胁，了解根际桂花分布白僵菌香，安徽省Gu阳县。际土壤样品很大程度上收集在三个区域中萧县和蒙城，37和球孢白僵菌菌株的县种植桂花通过稀释和分离[22]进行分离。本文中，我们使用了ISSRPCR技术来识别来自不同区域的基因结构和遗传关系白僵菌，并研究DNA地图白僵菌和应变的地理起源之间的关系。进一步研究37种菌株对桂花地下病虫害和土传病害的生物防治效果提供依据。37株白僵菌分离在涡阳，萧县和蒙城县安徽收集桂花根际土壤是通过用相关联的ADNr-形态学方法鉴定ITS以Beauveria bassiana的名义。阳阳县有22株，分别为GY1 - GY4，GY6 - GY20，GY22，GY23，GY25;蒙城县9号，编号MC2，MC7 - MC14;萧县6号，编号XX1，XX3，XX5，XX6。XX12，XX13。SDAY培养基[23]：酵母渗滤液10克;蛋白胨10克;葡萄糖40克;琼脂15克; 1000毫升水。Taq DNA聚合酶购自TaKaRa; dNTPs，DNA标记物等购自上海圣工生物工程有限公司40个ISSR引物由上海英俊生物技术有限公司合成。试验菌株中的孢子悬浮液转化，0.2毫升在25℃下转移至介质SDAY板涂覆玻璃纸并放置在恒温培养箱中4〜6天，将其侵入没有多少数量。无菌条件下除去孢子形菌丝体，置于无菌5ml微量离心管中，桂花树价格冻干并储存在-20℃直至使用。用改良的CTAB方法[24]提取白僵菌的基因组DNA。

　　过1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。Eppendorf分光光度计测量浓度后，将样品浓度稀释至50ng /μL使用。了获得有效的ISSR分子标记，对40种合成的ISSR引物进行初步预选试验。用10株GY1-GY6，MC2，MC6，XX1和XX3的DNA作为模板，在25μL反应体系中检测引物的扩增和再现性。
　　40个引物的37个souches.Les号码和引物序列进行PCR扩增选择具有清晰的多态性，重复性高十一ISSR引物示于表1扩增反应与ISSRPCR反应系统25微升：超纯水（ddH 2 O中）19.5微升，10×缓冲液缓冲液（含Mg 2+的）2.5微升，的dNTP（浓度为2.5mmol / L）1.25微升，引物（浓度为10毫摩尔/ L 0.1μL，Taq DNA聚合酶（5U /μL）0.2μL，50ng /μL的0.5μL模板DNA。PCR扩增过程ISSR：预变性94℃5分钟，变性在45℃下45秒，退火温度1分钟，延伸72℃1分钟，35个循环，延伸在72℃ 10分钟每种引物测试三次，每个反应用无矩阵空白对照物制备。过2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。动读取ISSR电泳凝胶图像，并将每个扩增的片段计数为多态性位点。ISSR是显性标记和各样品的扩增条带被记录有或没有带，条带1和条带无0 DNA凝胶的电泳图被转换成数值矩阵。物NTSYSpc 2.1软件被用于使用软件PopGen 32分析所有人群和所有种群的遗传参数来分析每个应变之间的关系的树，并计算观察到的等位基因的数目（NA）。位基因数（NE），基因多样性指数NEI（1973年）（他），索引信息香农多样性（I），多态位点（PPL）的百分比，基因内基因多样性（HS）基因总人口多样性（Ht），群体间遗传分化系数（Gst），Nei遗传距离（1978）（D）和遗传同一性（I）。预试验中，选择40个引物，并调整为与确定的结果stables.Les 11米的引物具有良好的多态型的光带不同的引物的退火温度被用来分析37株球孢白僵菌。态性检测。表2所示，11种引物能够扩增所测试的37种菌株的光和亮条带，并且条带以合理的方式分布。同引物共扩增出83条带，其中多态性带69条，多态性百分率为83.13％。

　　物P59（（AG）8YC）扩增条带的最大数目，条的数目为12，多态性条带的数量为10和多态位点的比率为83.33％。物P6，P11，UBC813和UBC825的扩增条带具有最高比例的多态性位点，均代表100％。UBC813引物（（CT）8A）扩增了最小数量的条带，只有两条。个引物扩增的平均条带数为7.5。果表明，11个引物具有一定的标记多态性，ISSR标记可以产生有效的多态性条带，但多态性水平不同。了分析遗传多样性白僵菌的地理起源的影响，在涡阳县，桂花树价格萧县和蒙城县的三个不同区域选择安徽省测试菌株ISSR分子标记的。果表明，在安徽白僵菌性别延胡索冬虫夏草具有丰富的遗传多样性，但11个引物进行测试缺乏特异性引物，反映了应变和特定原产地家谱地理。P59和UBC834引物的ISSR光谱示于图1的从安徽的不同区域收集37株种群的遗传多样性的结果表明，该种球孢白僵菌的一般水平具有高百分比的多态性基因座（PPL），PPL = 83.13％（表）。3）等位基因的每个位点的数目平均数Ne =（1.558±0.364 9 6），NEI他=（0.316±0.183 9 0），信息Shannon指数I =（0465±7的遗传多样性的指数0.250 9）。人群中，在不同的组多态位点比例相当不同：多态位点（PPL）人口白僵菌的比例为81.93％和多样性NEI基因指数（他）为0.319 7的香农的信息（I）的多样性指数为0.467 4，而多态位点（PPL）人口白僵菌的比例为68.67％，而遗传多样性NEI（他）的指数为0.288 1香农多样性指数（I）为0.415 3，多态位点（PPL）人口白僵菌的比例为39.76％，在遗传多样性指数（Nei）为0.168，Shannon多样性指数（I）为0.242。8使用POPGENE 32计算出遗传变异的结果表明（表4）：有白僵菌不同组之间的一些遗传分化，和三个群体的总遗传多样性0.301和1群体内遗传多样性为0.258 8. Nei基因分化系数为0.140 4，表明群体间存在14.04％的遗传变异，其中85.96％为遗传变异存在于群体中，遗传分化优于群体分化。

　　
　　体之间的基因流动为1.530 8.表3-5显示三个群体之间的基因流动和由此产生的基因分化差异很大，包括在阳阳县和Gu阳县的基因流动。城是最大的（4，563 7），基因分化系数最低（0，051 9），两个采样点之间的地理距离为44 km。蒙城和萧县县基因流最低（1.237 1），基因分化系数最高（0.168 1）和两个采样点之间的地理距离为133公里。Gu阳县和萧县的基因流量为1，889 7，基因分化系数为0.116。个采样点之间的地理距离为84公里。表明遗传分化系数与地理位置无关。过使用软件来涡阳，蒙城和萧县的县的三个群体的两个群体之间分析POPGENE 32 NEI遗传同一性（I）和标准遗传距离（d）中，我们发现，不同区域之间的遗传距离（ D）在0.048和0.1244之间，平均值为0.085，遗传同一性（I）在0.883和0.952之间，平均值为0.918（表3-6）。中，涡阳和蒙城之间的遗传一致性最高（0.952 4）中，遗传距离是接近的（0.048 8），蒙城和萧县间的遗传一致性是最低（0.883 0）和遗传距离是最远的（0.124）。4）根据扩增的ISSRPCR条带的存在或不存在，计数稳定和清晰的条带，计数为0.1。

　　据个体之间的相似性系数，使用NTSYSPC软件进行UPGMA聚类分析。孢白僵菌菌株的遗传系统发育图谱。（图2）的ISSR聚类图显示出37株测试进行分组时，SM相似系数为0.64和分成四组，当相似系数为0.72，第一大组（ I类）包含GY1，GY2，GY18，GY11，GY4，XX1，XX12，GY16，GY7，GY12，GY19，GY14，MC14，GY22，GY23，MC13，XX3，MC11，GY15，GY17，XXY，GY17，XX5， GY25，XXY，MC2，MC10。XX13株有26株;第二大组（II类）包括GY3菌株GY6，GY8和MC74，第三大组（III类），该菌株GY10 MC12，GY13，MC8和MC9 5;大组（IV类）包含两株GY9和GY20。中，菌株GY14和MC14关系最密切，遗传相似系数达到0.95。2还显示测试的37个菌株不根据地理种群聚类，进一步表明种群之间的遗传变异较少。分子标记如RAPD和AFLP相比，ISSR分子标记是理想的检测，因为它们的长的引物序列的种内的遗传变异的分子标记它们的高退火温度，其可再现性和其易于使用。]。而，对于ISSR分子标记，不同引物的退火温度对测试结果的影响更大。火温度过低，扩增特异性低，杂质带较宽，底部深，退火温度过高时，引物和模板结合很差，带电泳很弱，没有扩增。进行0/1矩阵统计时，不可能区分它是一个多样的波段还是电泳波段很弱，肉眼难以判断，这是由于删除一些有用的网站，并对不同的条带进行计数更多，这直接导致测试结果的偏差，导致以前结果的偏差。
　　该研究中，通过初步实验调节一些引物的退火温度。是，该测试没有研究其他因素的影响，如仪器类型，反应体积等。于扩增产品。者检查了实验前置放大器40个引物和扩增引物stables.Les 11个引物的37好多态性扩增多态性株白僵菌和分析了放大地图ISSR 。物表现出较高的遗传多态性，多态性条带达到83.13％，扩增结果具有高度可重复性。此，ISSR分子标记是研究白僵菌等白僵菌的遗传多样性和种群结构的有效方法。POPGENE 32软件进行了分析，分析了安徽省不同地区37株的群体遗传多样性。果表明，从安徽省3个不同地区分离的球孢白僵菌的遗传多样性优越，呈多态性。因座百分比（PPL）为83.13％，Nei遗传多样性指数为0.316，Shannon信息指数为0.465 7.遗传变异的结果表明存在分化。同的遗传群体白僵菌之间：三个群体的总遗传多样性是0.140 4.使用软件群体内0.301 1遗传多样性0.258 8和分化NEI基因的系数NTSYSPC，基于个体之间的遗传距离构建了37株球孢白僵菌菌株的遗传系统发育图谱。果表明，37个测试菌株不按地理种群聚类，分类组按地理划分。源之间没有直接的相关性，进一步表明种群间的遗传变异较小，可能是因为从桂花根际土壤中分离出的37株白僵菌（Beauveria bassiana）。在于根际土壤中。孢白僵菌可以受到土壤中复杂环境因素的影响，并且可以进行突变以适应相应的环境变化。项研究的结果表明，涡人口涉及的所有群体，表明人口有最大的遗传异质性，第二是蒙城，谁没有第Ⅲ部分的人口，而人口xiaoxienne具有最低的遗传异质性，并且汇集了所有七个菌株。第一个主要类别。
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