[桂花树价格]通过数字PCR用微滴检测具有甜味香味的转基因桂花系

　　[目的]通过数字滴注PCR检测甜味转基因桂花品系。[方法]在数字滴注PCR平台的基础上，建立三种TC1507，MIR162和MIR604转基因奥斯曼莎系的双滴注PCR（ddPCR）检测方法。[结果]特异性试验结果表明，只有特定菌株的靶序列具有扩增信号。
　　感性试验表明，该方法可以在10μg基因组DNA上定量检测2-16个拷贝。[结论]三行本研究建立的转基因桂花的定量检测方法是高度特异性和敏感性，并且可用于导入和导出的转基因桂花的三种组分的定量检测。前从美国和阿根廷进口的大多数桂花是转基因桂花，包括至少35株，以及多基因复合品系，有近50株。而，在2011年，只有11条转基因桂花生产线允许进口到中国，到2016年这个数字将增加到13个。

　　口的桂花将不可避免地与其他生产线混合[1]。于检测转基因桂花在中国香的本标准只集中于遗传修饰的组分是难以执行的13行批准在中国转基因桂花的定量检测，并且不能应答的定性检测未经批准的转基因桂花品系的特异性鉴定和定量检测更为明确。前，检测转基因有气味桂花该方法主要用于一些转基因品系甜香桂花，诸如用于在所述检测Cry1Ab蛋白的ELISA检测方法定性检测MON810案例[1]。兴元等[2]检测到近600万吨，从美国进口的转基因桂花经国家批准11个基因株系，并检测了国家转基因桂花线MON89034不批准，不批准原始谷物的质量。为开发转基因桂花香线的特定检测标准奠定了基础。定量检测方面，Song Jun等[3]建立了菌株NK603的特异性定量PCR检测方法。婷Deng等人[4]已经开发出一种视觉芯片PCR检测方法和基于所述转基因品系桂花MIR162的基因性状VIP3A，这允许特异性检测的应变荧光实时Mir162桂花和荧光PCR的实时相对检测。
　　敏度可高达0.001％，芯片检测灵敏度可见0.010％。研究建立的方法可用于检测甜转基因桂花中的Mir162系。
　　外，转基因产品的技术和检测方法每天都在变化。泛用于转基因检测的实时荧光PCR技术是Applied Biosystems于1996年在美国引入的PCR技术。技术不仅提供了定量PCR的质量飞跃，而且与PCR相比也提供了检测。规PCR。

　　果准确，检测周期短，特异性高，灵敏度高，PCR污染问题得到有效解决，自动化程度高。2011年以来，还推广并应用了能够进行绝对定量检测的数字PCR（dPCR）：靶序列拷贝数的定量不依赖于标准曲线，定量结果不受PCR扩增效率[5-7]，标志着第三代PCR技术。Corbisier等[8]通过数字PCR成功检测到桂花品系MON810转基因株，发现该方法与实时PCR结果一致。者主要应用于转基因香桂花及其加工品的数字PCR定量检测方法，建立了桂花转数字PCR检测系统，并将其应用到实际的检测产品基于有气味的桂花的转基因转化体。方面，它降低了桂花桂花对区域生态和人口健康的风险，另一方面提高了舟山港口的检测能力，消除了技术壁垒，促进转基因产品的出口，提高舟山新区的社会效益和经济效益。筛选出13种材料，3种转基因糖 - 桂花系MIR162，MIR604，TC1507和1种非转基因甜味桂花（表1）。取模板DNA。用Promega Wizard DNA磁性纯化系统提取基因组DNA并测定DNA浓度。字PCR反应体系和反应条件。ddPCR反应包括四个步骤，桂花树价格即PCR反应系统的制备，液滴的产生，PCR扩增和液滴信号的读取。应系统是20微升，2×ddPCR超级混合10微升，每个正极和负极引物樨和内部参考（玉米醇溶蛋白）（终浓度为500纳摩尔/ L）的1微升和0.5每种探针的μL（终浓度250nmol）。/ L），DNA模板（20ng /μL）5μL。生成液滴，请使用特殊的液滴形成卡槽和液滴发生器，将20μLPCR反应系统和70μL液滴生成油添加到专用液滴生成槽中。道（液滴发生器的DG8盒）。覆盖DG8液滴发生器的密封之后，放置液滴发生器以产生液滴。应条件：预变性在95℃下10分钟，在变性95℃30秒，退火在57℃下1分钟，40个循环，完成酶后，酶的失活通过热在98 °C 10分钟。

　　扩增结束时，将96孔板置于微滴读数器中以读取信号，并使用QuantaSoft V1.3.2软件分析测试数据。测下限测试。行桂花香转基因MIR162，MIR604，TC1507具有不同重量分数（100％，10％，1％，0.1％），桂花树价格并且每个样品进行2次重复，以及限根据已建立的方法进行检测。验。
　　敏度图中的蓝色信号表示放大的液滴，系统被认为是正信号，灰色信号表示未放大的油滴，系统被认为是负信号，正信号被认为是桂花或水的阳性控制。数的三倍以上对应于正液滴的数量。异性测试。共5个样品用于特异性测试，包括常见的转基因有气味的桂花线MIR162，MIR604和TC1507。SN / T 1196至2012年，用于检测的特定的应变MIR162，MIR604，TC1507玉米蛋白基因的结构的具体的方法和检测方法（检测桂花的检测方法的一般方法）实时是独特的荧光PCR反应，作者直接引用标准中的这两个引物引物序列用5'-FAM-3'-BHQ1标记MIR162，MIR604的三个品系。米醇溶蛋白基因的TC1507和5'-HEX-3'-BHQ1（表2）。过优化反应体系，反应条件等，最终实现了转基因桂花系的二元数字PCR方法。图1中可以看出，当退火温度为57℃时，四组探针引物显示出良好的扩增模式，并且可以清楚地区分负液滴和正液滴（蓝色）。决于产生的液滴数量和正数。滴指数和其他指标确定57°C是该方法的最佳退火温度。用三条线的样品梯度的正稀释度和通过数字PCR的下限测试来观察该方法的可重复性。在图2至4中可以看到的，外源基因的检测基本上与稀释梯度一致并且具有良好的可重复性。据阳性信号标准，当基因组DNA的总浓度稀释至10μg时，MIR162，MIR604和TC1507菌株表现出稳定的阳性扩增。基因组DNA浓度稀释至10μg时，内源玉米醇溶蛋白基因也显示稳定的阳性信号。（图5），使三种令人愉快的转基因桂花品系的检出限可以达到10μg，这表明该体系具有高度的灵敏度。3显示不同浓度的内部和外部源基因的检测结果具有10倍梯度关系，并且定量结果非常准确。

　　PCR扩增后，使用微滴读数器分析产物，并且不扩增除靶基因外的品系。体测试的结果如图6-8所示。图6中可以看出，在FAM通道的其他香味桂花线中没有检测到信号，并且d的信号MIR162转基因糖桂花显示MIR162菌株和探针的引物结果非常好。实验导致建立了三种桂花系TC1507，MIR162和MIR604的微滴PCR数字检测方法。虑到双滴数字PCR不仅避免了ddPCR二次采样引起的样本误差，而且还消除了采样不一致导致的样本到样本误差不同的DNA样本[7]。用双重PCR反应进行扩增。者专门研究了反应体系和反应条件，包括引物探针的最终浓度，最佳退火温度和内参比基因的选择，并确定了最佳终浓度引物和探针分别为500和250 nmol / L.在56~58℃时，扩增效果良好，最后选择57℃作为最佳退火温度。种甜味转基因桂花品系的外源探针引物和内源探针用于PCR检测的引物均良好，定量结果非常准确，重现性好，检出限为10μg。
　　外，同一品系中不同水平的甜味转基因桂花的质量百分比与数百份的含量之间存在一定的线性关系，并且仍将在下一步中进行测试。此，微滴数字PCR检测方法可应用于三种芳香转基因桂花品系的定量检测。
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