[桂花树价格]桂花中WRKY基因的功能分析
时间：2019/10/10 6:42:00 浏览量：
【目的】分析WRKY基因在桂花生长和逆境中的功能，为阐明WRKY家族基因在马铃薯中的功能和作用奠定基础。花的生长和应激反应机理。[方法]利用生物信息学技术从桂花基因组中获得了三个具有相似进化关系的WRKY基因，并利用在线预测软件对其功能和结构进行了分析，以及荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）。析了三个基因在不同的桂花组织中以及在高盐，低温和干旱胁迫条件下的表达谱。因结果从桂花的基因组中获得了三个转录因子家族的三个WWY基因，类似于ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74，它们预测这三个蛋白质都位于细胞核中。时PCR结果显示，这三个基因均在桂花的不同器官中表达，但对组织表达具有特异性。盐处理24小时后，相对于对照，ZmWRKY55样基因的表达乘以4.5，而低温处理24小时后，ZmWRKY74样基因的表达增加。对照相比是2.1倍。【结论基因】ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74基因分别在桂花和ZmWRKY74的基因中起作用。[研究意义]转录因子WRKY是近年来在植物中发现的重要转录因子。的名称来自其在N端高度保守的氨基酸序列WRKYGQK，并且是高等植物转录因子的前十大家族之一。X22-23-H-X-H）或C2HC类型（C-X7-C-X23-H-X-C）。据WRKY结构域的数量和锌指结构序列的特征，WRKY蛋白可以分为三种主要类型。一类具有两个WRKY结构域，锌指结构类型为C2H2，第二类仅包含一个WRKY结构。本领域中，锌指结构的类型为C2H2，第三类也包含单个WRKY结构域，锌指结构的类型为C2HC。
据WRKY域中的进化关系和某些氨基酸模式，II类WRKY转录因子可细分为5个亚类（a至e）（Eulgem等，2000）。为转录因子，WRKY蛋白参与细胞中特定基因转录的调节，从而产生相应的细胞反应，以响应不同的外部刺激，包括非生物胁迫，例如高温，低温，紫外线，干燥或机械损坏等。能是生物压力，包括细菌，真菌或病毒感染。样，WRKY转录因子也主要参与调节植物的生长和发育过程，例如种子发育，胚发生，叶片衰老和代谢过程。此，研究WRKY基因在不同组织和压力下的表达特征以揭示其功能作用具有重要意义。Milarasan等，2015）等。
WRKY转录因子广泛参与植物的各种生理和生化过程，例如水稻基因OsWRKY89的过表达促进植物对紫外线的抗性（Wang等，2007），以及拟南芥基因AtWRKY25和AtWRKY33。两个基因均提高了植物对NaCl的耐受性（Zheng等，2006，2007）。水稻中，OsWRKY45的过表达促进拟南芥对干燥的耐受性，OsWRKY8的异源表达促进对拟南芥的耐受。sWRKY72的异源表达影响根系生长和胁迫耐受性（邱和于2009）；在103个Pear WRKY基因中，有44个PbWRKY在干旱条件下被上调（Huang等，2015）。高粱（Panicum miliaceum L.）中，干旱胁迫诱导了10个PmWRKY基因的表达，而低温胁迫则诱导了16个PmWRKY基因的表达。人，2016年）。[本研究的切入点]转录因子WRKY在植物的生长，发育和胁迫反应中起着重要作用，目前，该家族基因在植物中的数量和分布曾报道过桂花的基因组，但与ZmWRKY22相似，与ZmWRKY55相似。ZmWRKY74基因在高盐，低温和干旱胁迫下的响应模式尚未见报道。[要解决的关键问题]利用生物信息学技术从桂花基因组中获得了三个具有相似进化关系的WRKY基因，并利用预测软件对其功能和结构进行了分析。线以及荧光定量RT-PCR。QRT-PCR分析盐胁迫，低温和干旱条件下不同桂花组织中三个基因的表达模式，揭示了其作用和基因作用的基础WRKY家族对桂花的生长发育和应激反应。试材料是由中国热带农业科学院南亚热带研究所持有的桂花品系B73。用的植物RNA提取试剂盒购自北京华岳阳生物技术有限公司，逆转录试剂和实时PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由北京赛百生基因技术有限公司合成。自生物生物工程（上海）有限公司。2. 1待测材料的采样桂花的根，茎，叶，穗，幼果和蚕丝取自大田种植的桂花。样期是乳白色的。
于处理胁迫的设备包括B73种子发芽幼苗。植方法：种子发芽后，将其转移到1/2 Hoagland培养基中，并在（28±2）°C的培养箱中生长，在黑暗中光照14 h持续10 h，持续3周。后，选择均匀生长的幼苗进行下一步。验包括三种处理：（1）盐胁迫处理，将幼苗置于含有200 mmol / L NaCl的1/2 Hoagland培养基中，并分别于0、1、6和24取样。时; （2）干燥胁迫处理后，将幼苗置于含有20％PEG-6000的1/2 Hoagland培养基中，分别于0、1、6和24 h取样； （3）低温胁迫处理后，将幼苗置于室温下。4℃的培养箱中培养细胞，并以0、1、6和24小时的时间间隔取样。次处理重复3次，采样点为载玻片。所有样品切成约2 cm的小块，立即在液氮中冷冻，并转移至-80°C的冰箱中储存。org /）中的验证。花WRKY基因的ORF信息，氨基酸长度和染色体位置是从Phytozome数据库中获得的。Cgibin / PlantmPLoc.cgi）在线预测，使用基因结构显示服务器（GSDS）在线软件（http：//gsds.cbi.pku）分析了基因内含子外显子的结构。edu.cn/）。用Clustal X进行多个序列比对，并使用MEGA 6.0进行氨基酸序列同源性分析和系统发育分析，以构建系统发育连接树。
有1000个重复的邻居，所有默认设置。2. 3使用华岳阳生物技术有限公司植物RNA提取试剂盒从不同材料提取的RNA植物的总RNA提取和qRT-PCR分析。京，然后使用TaKaRa PrimeScript RT试剂盒作为模板逆转录cDNA。
关具体步骤，请参阅说明。据本研究中桂花WRKY基因的CDS序列，设计了qRT-PCR引物，并以肌动蛋白基因作为内部参考基因（具体引物序列见表1）。于qRT-PCR反应的仪器是Roche's LightCycler 480，而qRT-PCR反应酶是TaKaRa SYBR Green Master Mix。20μl反应体系，40 ng模板cDNA，桂花树价格250 nmol / L的上游和下游引物，10μlSYBR Green Master Mix和其余的填充ddH2O。增步骤：在94°C下预变性5分钟，在94°C下10秒，在59°C下20秒，在72°C下30秒，熔解曲线为40个循环（95， 65°C，0.1°C /秒）。用2-ΔΔCt计算基因的相对表达水平。阴性对照将所有样品重复3次。
分析基因的表达时，认为向上或向下调节超过2倍时存在差异。Phytozome和MaizeGDB中，获得了具有相似进化关系的WRKY转录因子家族的三个基因，分别是ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74。中列出了这三个基因的基因id，基因座和染色体位置。图2和图1所示。中，ZmWRKY22型基因序列的开放阅读框为729 bp，编码242个氨基酸，分子量为27.42 kD，理论等电点为。5.67，位于桂花的八号染色体上； ZmWRKY55基因序列的开放阅读框为645 bp。编码214个氨基酸，分子量为23.28 kD，理论等电点为8.94。位于桂花的1号染色体上，ZmWRKY74基因序列的开放阅读框为996 bp，编码331个氨基酸，分子量为34.78 kD。电点为6.09，位于桂花的II号染色体上。测表明这三个基因都位于细胞核中。析这三个基因的氨基酸序列，发现ZmWRKY55类似的ZmWRKY22-like和ZmWRKY74-like蛋白都包含一个WRKY域，类似于ZmWRKY55-like七肽，并且两者其他蛋白质是WRKYKK。种蛋白质的锌指结构与C-X7-C-X23-H-X1-C型相同。据转录因子WRKY的分类原理，ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74型蛋白属于III类WRKY转录。子KY35，OsWRKY55和ZmWRKY74与SiWRKY70和OsWRKY74关系最密切，同源性最高，但在同一分支中与拟南芥WRKY蛋白却相距甚远。ZmWRKY74样基因在桂花的根，茎，叶，穗，幼果和丝中的表达表明三个基因在桂花的不同组织中表达（图3）ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74型基因在丝，茎和根中的相对表达最弱，而ZmWRKY55基因和ZmWRKY55基因的相对表达最弱。果中的ZmWRKY74显着高于其他组织。和根中的相对表达水平分别为6.1和22.5％，而ZmWRKY22-like基因在叶片和幼果中的相对表达较高，这是丝绸中的相对表达。19.7和12.5倍。三周大的桂花幼苗为材料，以200 mmol / L NaCl和20％PEG-6000模拟盐，干旱和低温下的高胁迫，并通过ZRT-PCR用于ZmWRKY22-like和ZmWRKY55-在不同胁迫处理下相似和ZmWRKY74-like基因的表达。4的结果表明，在盐胁迫和干旱条件下，ZmWRKY22样基因在6 h时被下调，分别是对照的0.28和0.35倍，但恢复正常。24小时控制水平；在干旱和低温的处理过程中，其表达没有明显变化。5的结果表明，在盐胁迫下，ZmWRKY55样基因在24小时被上调，即是对照的4.5倍。干旱和低温处理期间，其表达没有明显改变。
6的结果表明ZmWRKY74型基因仅在低温胁迫下被上调，并且在24小时时表达水平是2.1倍。干旱和盐胁迫下，表达没有明显变化。WRKY是植物中重要的转录因子家族，也是植物转录因子最大的家族之一（Yan等，2015）。WRKY转录因子介导各种植物的生长和发育过程，例如种子发芽，叶和根的生长，开花和衰老。量研究表明，WRKY基因家族在不同的植物器官中不组成性表达。MdWRKY85，MdWRKY120和MdWRKY131无法检测到组织表达，MdWRKY1和MdWRKY110仅检测到根部表达，而MdWRKY16仅在花中表达。Shi Hongmei及其合作者（2015年）表明，PsWRKY基因主要在牡丹叶和心皮中表达，在其他器官中的表达非常弱。KY114在茎中表达最高，NtWRKY28，NtWRKY81和NtWRKY163在茎中表达最高。WRKY基因家族中也发现了类似的结果，例如拟南芥（Lker and Somssich，2004）和番茄（Huang et al。2012）。项研究的结果表明，ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY型基因的表达水平分别在桂花丝，茎和根以及ZmWRKY55和ZmWRKY74基因中最低。年轻人中最高。ZmWRKY22样基因在叶片和幼果中的表达水平较高，表明这三个WRKY基因可能参与了桂花不同组织器官的发育。花是世界上最重要的粮食作物之一，也是重要的动物饲料和工业原料作物，在世界谷物总产量中排名第一（Zhou Wei，2013） 。为世界第二大桂花生产国，中国的桂花产量在过去30年中增长迅速，总产量也逐年增加。农组织统计数据库（FAOSTAT）显示，2012年桂花产量超过稻谷产量，成为中国最大的粮食作物（Yang Jinsheng等，2013）。2013年，中国桂花的年种植面积达到3510万公顷，总产量约为2.17亿吨，占谷物总产量的1/3。而，在实际生产中，桂花常常受到许多不利的环境因素的影响，例如干旱，盐胁迫和低温。燥和高盐含量导致渗透胁迫，这不仅影响植物组织细胞的离子和渗透平衡，而且破坏细胞的代谢平衡，导致植物组织的反应性物种积累。气，严重影响植物的生长和产量。发现WRKY以来，许多植物都报道了WRKY蛋白参与干旱和盐胁迫的报道。如，在拟南芥中，桂花树价格有将近2，000个对干旱敏感的基因，包括许多WRKY基因（Huang等，2008）。AtWRKY25和AtWRKY33在干燥和高盐含量以及其异源处理方面得到了提高。达提高了转基因植物对NaCl的耐受性（Jiang和Deyholos，2009年）。AtWRKY54和AtWRKY70通过调节气孔开口来增强植物对渗透胁迫的耐受性（Li等人，2013）； OsWRKY45的过表达增强了转基因植物对盐和干旱的耐受性（Qiu和Yu，2009）； VvWRKY11的过表达提高了拟南芥转基因植物对干旱的耐受性（Liu等人，2011）。Y61和TaWRKY82（Okay等人，2014）。
这些研究相似，在这项研究中，高盐处理中的ZmWRKY55型基因显示出对盐的特定应激反应，并且在处理后24小时受到正调控，相当于4，是对照的5倍，表明ZmWRKY55基因可能参与植物对。胁迫反应的过程。温和低温也构成植物重要的非生物胁迫。
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桂花树价格 http://m.guihua99.net/m/
据WRKY域中的进化关系和某些氨基酸模式，II类WRKY转录因子可细分为5个亚类（a至e）（Eulgem等，2000）。为转录因子，WRKY蛋白参与细胞中特定基因转录的调节，从而产生相应的细胞反应，以响应不同的外部刺激，包括非生物胁迫，例如高温，低温，紫外线，干燥或机械损坏等。能是生物压力，包括细菌，真菌或病毒感染。样，WRKY转录因子也主要参与调节植物的生长和发育过程，例如种子发育，胚发生，叶片衰老和代谢过程。此，研究WRKY基因在不同组织和压力下的表达特征以揭示其功能作用具有重要意义。Milarasan等，2015）等。
WRKY转录因子广泛参与植物的各种生理和生化过程，例如水稻基因OsWRKY89的过表达促进植物对紫外线的抗性（Wang等，2007），以及拟南芥基因AtWRKY25和AtWRKY33。两个基因均提高了植物对NaCl的耐受性（Zheng等，2006，2007）。水稻中，OsWRKY45的过表达促进拟南芥对干燥的耐受性，OsWRKY8的异源表达促进对拟南芥的耐受。sWRKY72的异源表达影响根系生长和胁迫耐受性（邱和于2009）；在103个Pear WRKY基因中，有44个PbWRKY在干旱条件下被上调（Huang等，2015）。高粱（Panicum miliaceum L.）中，干旱胁迫诱导了10个PmWRKY基因的表达，而低温胁迫则诱导了16个PmWRKY基因的表达。人，2016年）。[本研究的切入点]转录因子WRKY在植物的生长，发育和胁迫反应中起着重要作用，目前，该家族基因在植物中的数量和分布曾报道过桂花的基因组，但与ZmWRKY22相似，与ZmWRKY55相似。ZmWRKY74基因在高盐，低温和干旱胁迫下的响应模式尚未见报道。[要解决的关键问题]利用生物信息学技术从桂花基因组中获得了三个具有相似进化关系的WRKY基因，并利用预测软件对其功能和结构进行了分析。线以及荧光定量RT-PCR。QRT-PCR分析盐胁迫，低温和干旱条件下不同桂花组织中三个基因的表达模式，揭示了其作用和基因作用的基础WRKY家族对桂花的生长发育和应激反应。试材料是由中国热带农业科学院南亚热带研究所持有的桂花品系B73。用的植物RNA提取试剂盒购自北京华岳阳生物技术有限公司，逆转录试剂和实时PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由北京赛百生基因技术有限公司合成。自生物生物工程（上海）有限公司。2. 1待测材料的采样桂花的根，茎，叶，穗，幼果和蚕丝取自大田种植的桂花。样期是乳白色的。
于处理胁迫的设备包括B73种子发芽幼苗。植方法：种子发芽后，将其转移到1/2 Hoagland培养基中，并在（28±2）°C的培养箱中生长，在黑暗中光照14 h持续10 h，持续3周。后，选择均匀生长的幼苗进行下一步。验包括三种处理：（1）盐胁迫处理，将幼苗置于含有200 mmol / L NaCl的1/2 Hoagland培养基中，并分别于0、1、6和24取样。时; （2）干燥胁迫处理后，将幼苗置于含有20％PEG-6000的1/2 Hoagland培养基中，分别于0、1、6和24 h取样； （3）低温胁迫处理后，将幼苗置于室温下。4℃的培养箱中培养细胞，并以0、1、6和24小时的时间间隔取样。次处理重复3次，采样点为载玻片。所有样品切成约2 cm的小块，立即在液氮中冷冻，并转移至-80°C的冰箱中储存。org /）中的验证。花WRKY基因的ORF信息，氨基酸长度和染色体位置是从Phytozome数据库中获得的。Cgibin / PlantmPLoc.cgi）在线预测，使用基因结构显示服务器（GSDS）在线软件（http：//gsds.cbi.pku）分析了基因内含子外显子的结构。edu.cn/）。用Clustal X进行多个序列比对，并使用MEGA 6.0进行氨基酸序列同源性分析和系统发育分析，以构建系统发育连接树。
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分析基因的表达时，认为向上或向下调节超过2倍时存在差异。Phytozome和MaizeGDB中，获得了具有相似进化关系的WRKY转录因子家族的三个基因，分别是ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74。中列出了这三个基因的基因id，基因座和染色体位置。图2和图1所示。中，ZmWRKY22型基因序列的开放阅读框为729 bp，编码242个氨基酸，分子量为27.42 kD，理论等电点为。5.67，位于桂花的八号染色体上； ZmWRKY55基因序列的开放阅读框为645 bp。编码214个氨基酸，分子量为23.28 kD，理论等电点为8.94。位于桂花的1号染色体上，ZmWRKY74基因序列的开放阅读框为996 bp，编码331个氨基酸，分子量为34.78 kD。电点为6.09，位于桂花的II号染色体上。测表明这三个基因都位于细胞核中。析这三个基因的氨基酸序列，发现ZmWRKY55类似的ZmWRKY22-like和ZmWRKY74-like蛋白都包含一个WRKY域，类似于ZmWRKY55-like七肽，并且两者其他蛋白质是WRKYKK。种蛋白质的锌指结构与C-X7-C-X23-H-X1-C型相同。据转录因子WRKY的分类原理，ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74型蛋白属于III类WRKY转录。子KY35，OsWRKY55和ZmWRKY74与SiWRKY70和OsWRKY74关系最密切，同源性最高，但在同一分支中与拟南芥WRKY蛋白却相距甚远。ZmWRKY74样基因在桂花的根，茎，叶，穗，幼果和丝中的表达表明三个基因在桂花的不同组织中表达（图3）ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY74型基因在丝，茎和根中的相对表达最弱，而ZmWRKY55基因和ZmWRKY55基因的相对表达最弱。果中的ZmWRKY74显着高于其他组织。和根中的相对表达水平分别为6.1和22.5％，而ZmWRKY22-like基因在叶片和幼果中的相对表达较高，这是丝绸中的相对表达。19.7和12.5倍。三周大的桂花幼苗为材料，以200 mmol / L NaCl和20％PEG-6000模拟盐，干旱和低温下的高胁迫，并通过ZRT-PCR用于ZmWRKY22-like和ZmWRKY55-在不同胁迫处理下相似和ZmWRKY74-like基因的表达。4的结果表明，在盐胁迫和干旱条件下，ZmWRKY22样基因在6 h时被下调，分别是对照的0.28和0.35倍，但恢复正常。24小时控制水平；在干旱和低温的处理过程中，其表达没有明显变化。5的结果表明，在盐胁迫下，ZmWRKY55样基因在24小时被上调，即是对照的4.5倍。干旱和低温处理期间，其表达没有明显改变。
6的结果表明ZmWRKY74型基因仅在低温胁迫下被上调，并且在24小时时表达水平是2.1倍。干旱和盐胁迫下，表达没有明显变化。WRKY是植物中重要的转录因子家族，也是植物转录因子最大的家族之一（Yan等，2015）。WRKY转录因子介导各种植物的生长和发育过程，例如种子发芽，叶和根的生长，开花和衰老。量研究表明，WRKY基因家族在不同的植物器官中不组成性表达。MdWRKY85，MdWRKY120和MdWRKY131无法检测到组织表达，MdWRKY1和MdWRKY110仅检测到根部表达，而MdWRKY16仅在花中表达。Shi Hongmei及其合作者（2015年）表明，PsWRKY基因主要在牡丹叶和心皮中表达，在其他器官中的表达非常弱。KY114在茎中表达最高，NtWRKY28，NtWRKY81和NtWRKY163在茎中表达最高。WRKY基因家族中也发现了类似的结果，例如拟南芥（Lker and Somssich，2004）和番茄（Huang et al。2012）。项研究的结果表明，ZmWRKY22，ZmWRKY55和ZmWRKY型基因的表达水平分别在桂花丝，茎和根以及ZmWRKY55和ZmWRKY74基因中最低。年轻人中最高。ZmWRKY22样基因在叶片和幼果中的表达水平较高，表明这三个WRKY基因可能参与了桂花不同组织器官的发育。花是世界上最重要的粮食作物之一，也是重要的动物饲料和工业原料作物，在世界谷物总产量中排名第一（Zhou Wei，2013） 。为世界第二大桂花生产国，中国的桂花产量在过去30年中增长迅速，总产量也逐年增加。农组织统计数据库（FAOSTAT）显示，2012年桂花产量超过稻谷产量，成为中国最大的粮食作物（Yang Jinsheng等，2013）。2013年，中国桂花的年种植面积达到3510万公顷，总产量约为2.17亿吨，占谷物总产量的1/3。而，在实际生产中，桂花常常受到许多不利的环境因素的影响，例如干旱，盐胁迫和低温。燥和高盐含量导致渗透胁迫，这不仅影响植物组织细胞的离子和渗透平衡，而且破坏细胞的代谢平衡，导致植物组织的反应性物种积累。气，严重影响植物的生长和产量。发现WRKY以来，许多植物都报道了WRKY蛋白参与干旱和盐胁迫的报道。如，在拟南芥中，桂花树价格有将近2，000个对干旱敏感的基因，包括许多WRKY基因（Huang等，2008）。AtWRKY25和AtWRKY33在干燥和高盐含量以及其异源处理方面得到了提高。达提高了转基因植物对NaCl的耐受性（Jiang和Deyholos，2009年）。AtWRKY54和AtWRKY70通过调节气孔开口来增强植物对渗透胁迫的耐受性（Li等人，2013）； OsWRKY45的过表达增强了转基因植物对盐和干旱的耐受性（Qiu和Yu，2009）； VvWRKY11的过表达提高了拟南芥转基因植物对干旱的耐受性（Liu等人，2011）。Y61和TaWRKY82（Okay等人，2014）。
这些研究相似，在这项研究中，高盐处理中的ZmWRKY55型基因显示出对盐的特定应激反应，并且在处理后24小时受到正调控，相当于4，是对照的5倍，表明ZmWRKY55基因可能参与植物对。胁迫反应的过程。温和低温也构成植物重要的非生物胁迫。
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