[桂花树价格]高品质桂花橙红心的遗传创新和新品种选择
时间：2019/10/18 6:37:28 浏览量：
在该实验中，遗传创新和芸s属植物新品种的选择。分子选择法进行北京会议。们克隆了控制桂花红心的关键基因BrCRTISO，并分析了桔红心桂花和白心之间BrCRTISO基因的结构差异。据启动子和编码区序列之间的差异，筛选了与橙色心脏密切相关的SNP和InDel分子标记。传统的有性杂交的基础上，使用上述SNP和InDel标记选择后代，获得了优质，抗病的橙红色心脏优良的成熟遗传物质。过滤：08428、08460、08468、08469关联部门。用上面的四个纯线条图案组合，已选择了一个新的大品种桂花，“天正橙65”和“天正橙62”。
东省桂花的主要产地之一，具有悠久的栽培和种质资源传统，其中包括胶东桂花，在国内外都广为人知。受济南人民爱戴的德州乡子的鲜明特色。旺达桂花等[2]。着中国农业部门结构的调整和保护区蔬菜的发展，第一季度大桂花的供应量发生了重大变化。着人口生活水平的不断提高，将更加注重大桂花的品质，即形状，大小，颜色，营养，口味和风味以及指标。污染。费者欣赏桔红色的桂花，因为它们色泽鲜艳，桂花树价格胡萝卜素和其他维生素含量丰富，营养价值高，口感好。本用橙红色心培育的桂花较早开始，并允许种植优良品种。是，在中国，日本的红桂花的种子价格昂贵，不能抵抗病毒疾病，并且经常在受灾严重的地区和多年中，很难获得高而稳定的产量。此，培育适合在山东等地种植的高病毒性疾病，晚疫病和软腐病的桔红色心型桂花新品种尤为重要。到他们的种子[3]。对上述问题，自2002年以来，研究小组已开始收集和鉴定包含桔红色心脏的桂花资源，以研究心脏性状的遗传特征。2007年到2010年，我们扩大了育种资源，将杂交组合与分子标记辅助育种技术相结合，并选择了新品种的橙红色心形桂花“天正橙65”，适合春秋季播种。色橙子62“ 2014年”“天真橙红色62”成为泰安市岱岳区的参考产品（品牌注册号：）。过了北京市和北京市农作物品种审定委员会的审查和评估，2016年“天珍橙红65”被省农作物品种审定委员会批准。东。
红心桔红桂花：北京桔红心，红抗-1，长颜橙宝，沉萌桔红心，沉石桔红心.Ostras桂花心红桔心：橙色08410， 14-490、1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-277、14-662、14-669百辛（或黄辛），桂花的优良杂交种：日本汉秀，金典纯王，开春和霞阳白心（或黄心），纯桂花纯线：新福08410、14-401、663、1466、1469、1505、1510、1 720，堆积锥电阻2。合组合（14-401 x 14-490）及其隔离F2中的种群。桂花的叶子中提取基因组DNA，将液氮冷冻并快速研磨，然后使用快速基因组DNA提取系统（Tiangen Biochemical Technology Co.，Ltd）提取。DNA）的检测通过在1％琼脂糖凝胶上的电泳进行。取总RNA，并从最后一个鳞茎的鳞茎中反转录，以提取总RNA。用TRNzol-A +试剂盒（Tiangen Biochemical Technology Co.，Ltd.）进行RNA提取，方法参考说明书。据TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit和gDNA Eraser产品说明书进行反转录。PCR扩增反应体系（20μL）如下：2 x高保真PCR PCR 10μL，上游引物（10 mmol / L）0.5μL，下游引物（10 mmol / L）0.5μL ，CDNA模板1μL，ddH2O 8μL。PCR反应过程如下：94℃3分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，36个循环，72℃10分钟。SDS-PAGE上将PCR产物与电泳上样缓冲液混合，并将混合物在95°C下预变性10分钟。去4ul的污渍，并用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并在Sequi-Gen GT核酸电泳系统（Bio-Rad，USA）中电泳分离。极缓冲液为1x TBE，在电泳下以恒定的°C和55 W功率进行1小时，通过银染显影，照相并记录。物信息学分析在GenBank中对克隆的基因序列进行BLAST搜索，以发现其他物种中大桂花靶基因的同源序列。用DNAMAN 6.0软件比对不同物种的基因编码的氨基酸序列，并构建系统树。高效液相色谱法测定桂花中的β-胡萝卜素含量[5-7]。取约5.0克成熟，干净的桂花叶，切成薄片，将其放在三角形的气球中，与石油醚：丙酮（体积比为80:20）摇动，除去上清液并重复萃取直至萃取液为无色并将萃取液合并，转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上蒸发至干，残余物用二氯甲烷溶液萃取，过滤并纯化。过凝胶装置。化的溶液用于HPLC分析。用Gilson高效液相色谱仪，色柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μm，流动相甲醇：乙腈（体积比为90:10），流速1.0 mL / min，检测波长450 M，进样量20μL。200至800 nm的波长下扫描PAD，桂花树价格以分析该物质的特征吸收峰。溶性固形物含量的测定基于“ NY / T 2637-2014水果和蔬菜中可溶性固形物含量的测定。光仪法（2015-1-1实施）”。谦及其合作者（2012）[4]和柯贵兰（2010）[1]研究了由分子标记和常规杂交辅助的选择性选择。普通桂花相比，桔红桂花的内叶为橙红色。割后，该切片暴露在阳光下，叶子的橙色很快得到改善。前的研究表明，桂花的内叶含有多种类胡萝卜素，例如番茄红素型复合物[5-7]。胡萝卜素通过类异戊二烯途径在植物中合成，并以黄色，橙红色和红色出现。
植物中，许多红橙色特征与类胡萝卜素异构酶有关。胡萝卜素异构酶CRTISO通过前番茄红素催化反式番茄红素的形成[9，10]。Park等人（2002年）[6]从拟南芥中分离了CRTISO基因，并分析了其功能。此，他们发现类胡萝卜素异构酶的缺失突变体主要积累前番茄红素和前抗生蛋白链菌素（7，9，9'-tris-顺-抗生蛋白链菌素）。Isaacson等人（2002年）[7]使用图谱克隆技术获得了橙红色番茄橘子基因，该基因编码类胡萝卜素异构酶CRTISO，而橘子突变体缺少CRTISO。致番茄中番茄红素和β-胡萝卜素的积累。实为橘红色。此，在筛选和控制大桂花橙心的关键候选基因时，我们首先选择了编码类胡萝卜素异构酶BrCRTISO的基因作为候选基因。外，与桂花相比，在露天切成橙红色的桂花叶子是黄色的。
考虑筛选和控制桂花橙大心形成的关键候选基因时，我们还应考虑控制黄心形成的关键基因。Galpaz等人（2006）[8]克隆了CrtR-b基因，该基因控制番茄中白花的形成，这是由编码β-胡萝卜素羟化酶的基因突变引起的。大桂花中，有三个CrtR-b成员，分别是BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3。类胡萝卜素代谢途径的基础上，我们选择了BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因作为筛选关键候选桂花基因的候选基因。桂花BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3不是控制叶片中红色核心形成的关键基因，2007年我们使用了番茄LsCrtR-b1的基因序列。
在GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索了由其编码的氨基酸序列及其EST和基因组序列。桂花中发现了三个CrtR-b（BrCrtR-b1）成员。BrCrtR-b2，BrCrtR-b3）。据上述信息，我们设计了引物，用于扩增BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因的cDNA序列。球的晚期，使用纯橙红色桂花亲本“ Orange 0840”和纯心桂花“ Xinfu 08410”扩增BrCrtR-b1，BrCrtR-b2，BrCrtR-b3 。因的cDNA序列。后，进一步扩增这三个基因的基因组序列。果表明，纯橙红心桂花亲本“ Orange 0840”和纯桂花白心“信福”之间，BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因的cDNA和基因组序列没有差异。08410”。得的BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因的cDNA和基因组序列与2011年出版的大桂花的基因组序列相同。11]我们使用了有关基因和蛋白质的信息Wang等人（2011）发表的BrCrtR-b3和BrCrtR-b2，BrCrtR-b3 [11]比较了桂花BrCrtR-b和番茄LsCrtR-b的氨基酸序列。1、2）。果表明，大桂花与番茄之间的CrtR-b氨基酸序列高度保守，一致性为75.11％。桂花BrCRTISO是控制球状红心形成的关键基因.2007年，我们使用了拟南芥AtCRTISO基因的序列（登录号AAF63149）及其在GenBank中编码的氨基酸序列（https： //www.ncbi.nlm.nih）。.gov（）搜索中，获得了相应的桂花EST序列信息（登录号EX023490，EX043675，EX040997，EX056774）。后将cDNA序列克隆到BrCRTISO基因的完整cDNA中。用DNAMAN软件对中华棉（使用Bra323539），拟南芥，番茄，水稻和矮牵牛进行了比较分析（图3和4）。果表明，BrCRTISO与AtCRTISO具有很强的同源性，氨基酸序列同一性达到88.63％，而BrCRTISO与OsCRTISO具有较低的同源性，并且该酸序列具有同一性。为70.65％。试材料扩增了BrCRISO基因的基因组序列和编码序列。果表明，BrCRISO基因的基因组序列和编码序列在“ Orange 0840”和“ Xinfu 08410”之间有显着差异。他种群验证结果表明，这种差异与红叶的心脏性状共隔离。此，我们假设大桂花BrCRTISO是控制橘红色心脏形成的关键基因。SNP和InDel分子标记与桂花叶的橙色心脏密切相关，分析了白色心脏和橙红色心脏的BrCRTISO基因序列，以及其他研究，并揭示了两者之间的较大序列差异。桂花。括大量的SNP和InDel。大量的SNP中，有7个SNP与橙色性状完全相关，但单个SNP（C952-T952）引起氨基酸突变（L318-F318）（图5）。外，使用F2杂种一代组，自然种群以及一些白心和橙心品种进行检测，发现SNP952与橙性状完全结合[12]。此，我们将SNP952作为分子标记，用于种质资源的选择和桂花新品种的培育。SNP952外，第一个内含子上的InDel（Bror-intron1）标记也已广泛用于新橙红色心脏的培养（图6）。标记位于BrCRTISO基因的第一个内含子上，其中橙红色心脏相对于白心脏有25个碱基的插入。标记物可用于快速，准确地识别大桂花遗传物质的不同资源是否具有橙红色心脏性状基因，并可以区分它们是纯合子还是杂合子[12]。有橙红色心脏的新桂花杂交种“洪志1号”具有抗霉变和软腐病的特性，并且具有优异的完整性状，但不具有抗病毒性疾病的能力。2007年，我们将高强度，高价值的百辛达桂花纯净的“抗2锥双重病”作为双交叉反应抗病毒的供体，然后使用了分子标记[橙红色心脏标记]。：Bror-intron1，SNP（C952-T952）； BRRV病毒疾病抗性标记：BrID10694，101309;耐热标记物：[BRRH]协助选择，转移了抗性，然后进行了几代的自我分离和筛选，从而获得了红橙心的10份纯净材料的新复制品（08462、08463、08468、08469 ，08471、08472、08475、08477、08480、08881）。些纯净的材料是自相容的，在野外对病毒性疾病的抵抗力很高，球坚硬，植物的形状及其结合能力都很好。珠的类型有：扣（浅绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（浅绿色的叶子），扣（绿色的叶子），拥抱（浅绿色的叶子），带扣（绿色的叶子），带扣（绿色的叶子）。们还推出了杂交种“北京橙红心”，对病毒，霉菌和甜腐病具有高度抵抗力。
2007年，我们使用分子标记（抗软腐标记：BRS1，抗白叶枯病标记：BRDM2）来帮助选择技术，并进行了多代纯化，并自动纯化了橙红心。京（F1混合动力）。相容性（08427，08428，08431，08435，08436，08437，08451，08460）。8条自交不亲和的品系具有紧密的球形成，出色的植物类型和经济特性，良好的结合能力以及对各种疾病的抵抗力。的类型有：扣子（叶绿色），拥抱（浅绿色叶子），拥抱（叶绿色），扣子（叶子绿色），扣子（叶子绿色），拥抱（浅绿色叶子颜色），环（颜色深绿色的叶子），循环（深绿色的叶子颜色）。Bror-intron1-F / R是标记为InDel橙红色的Bror-intron1正向/反向引物。
过将个体与14-401 x 14-490及其F2代分开来验证了Bror-intron1标记。1-11是白色心脏个体，12-19是橙色心脏个体。的桂花品种（12-23）是橙红色的桂花品种[12]。年，第一个组合测试。试结果表明，08428×08468（“天镇橙红色65”）和08469×08460（“天镇橙红色62”）的组合效果很好。过在2010年春季和秋季以及2011年春季和秋季通过现场产品比较测试，字符搜索和抗病性鉴定，确定这两种出色的组合适合特征性品种。季和秋季种植红绿色。正橙65中的β-胡萝卜素含量达到26.163 mg / g总重，是普通桂花的11.15倍，而可溶性固形物含量高于北京新三号和九号。道很好。霉，软腐病旺盛，捆扎牢固，收获期长。2014年，我们将地理标志证明商标“ Tian'an Huangye Guihua”（商标注册号：）与“ Tianzhen Orange Red 62”一起注册。2015年，“天真橙红65”和“天真橙红62”通过了国家和北京地区农作物品种审定委员会的审查和评估，2016年通过了“天真橙红65”。山东省农作物品种审定委员会审定。证天正橙65的高度为33厘米，有一个拥抱，生长期为65天，单个球重1.5到2.0千克，净蔬菜率为71.1％。子是鲜橙色的（图7）。项为期三年的国家区域试验的结果如下。2012年：秋季早熟品种，平均生长期为55至60天，品种纯度高，叶捆牢固，病害抗病毒性强，发霉软腐，单产蔬菜净重为70，080.0 kg / hm2，对照使产量增加了13.8％，单产显着提高。2013年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为60天，品种纯度高，叶捆牢固，抗病力强，腐烂和发霉，与对照相比，植物净产量为60 396.0 kg / hm2，增幅为8.6％，增幅显着。2014年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为60天，品种纯度高，叶片坚硬，抗病毒，防霉，软腐病蔬菜净产量为65 934.0 kg / hm2，高于对照。9.3％，显着提高产量。Tianzhengzuhong 62株高42厘米，株型紧凑，环状，生长55-60天，一包重约2.5公斤，净菜率71.3％，深橘红色，极好的口味质量（图7）。项为期三年的国家区域试验的结果如下。2012年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为74.9天，品种纯度高，叶捆牢固，抗病毒性强，霉变和在软腐病中，蔬菜净产量为64 605.0 kg / hm2，高于对照。4.9％。2013年：秋季早熟品种，平均生长期为73.9天，品种纯度高，球形坚硬，高度抗病毒病，抗晚疫病和甜腐病，产量高净植物产量为59 161.5 kg / hm2，相比之下见证者的产量增加了6.3％。2014年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为74.1天，品种纯度高，叶包牢固，病害抗病毒性强，腐烂和发霉蔬菜的净产量为66 682.5 kg / hm2，比对照增加了10.5％。品种天正橘65，天正橘红色62的栽培技术天正橘65，天正橘红色62的大桂花品种为早熟品种，类似于早熟大桂花的常用栽培技术。季播种时，每日温度应不低于13°C。于生长季节短，秋季可根据市场时期分阶段播种，山东地区可从8月10日到9月2日播种，种植面积为6万至75000株/ hm2；如果大约是120，000株植物/ hm2，则可以用作玩偶。碗的使用老蟑螂应尽量避免十字花科作物，并有良好的灌溉条件，肥沃的土壤，施用足够的基础肥料，及时覆盖并及时控制各种有害生物如卷心菜蠕虫和小菜蛾。两个新的桔红色桂花品种是春季和秋季品种，由于其质量和商业质量，它们适合盆栽蔬菜销售和在超市出售，并且可以在市场上种植。东和中国其他类似的生态区域。花红橙色心因其内叶的鲜艳色彩而得名。据以前的文献，桂花有橙红色的心有两种来源：一种是在日本引入的[13]，另一种是通过大桂花与一种生物技术杂交获得的新遗传物质。色萝卜[5]。]。本最古老的橘红色桂花花也是由日本桂花遗传育种家获得的，他利用有性杂交来转移桂花的酞菁抗性。此，控制橙红色心脏的桂花中橙红色心脏的形成的关键基因来自橙红色萝卜。
前，对桂花叶片颜色组成和遗传选择的研究显示了以下进展：（1）选择和扩展了一组新的红桂花品种橙色，可以丰富桂花市场并满足蔬菜需求[13-16]； （2）在大桂花中，橙红色的心脏是隐性性状，由单个基因控制； （3）参照拟南芥，番茄和其他示范作物，逐渐确定的桂花叶带有橙红色的心。包中的类胡萝卜素含量很高，而橙色是多余的。弹内叶中的类胡萝卜素，例如番茄红素[5，17-19]； （4）仅在2012-2015年。过去的三年中，许多研究小组独立报告了橙红色心脏链接图谱的研究结果，以及通过卡克隆克隆橙红色心脏基因的研究结果[17-24]。管这些方法和研究结果是相互交叉且相似的，但它们都是独立完成的。制大型橘红色桂花的形成的关键候选基因编码类胡萝卜素异构酶（CRTISO），基因编号Bra031539，位于A09染色体末端。们的团队介绍了2017年橙心心脏发育的转录组图谱结果。据BrCRTISO基因，开发了新的InDel分子标记和新的SNP标记[12]。两种标记都用于育种实践，并取得了良好的效果。管先前的研究取得了长足的进步，但橙红色心脏形成的分子机制和应用已变得越来越清晰，但仍未解决问题：BrCRTISO是促成心脏发生的关键候选基因。制橘子桂花形成红色的心。据完全删除了“候选人”一词。前，中国的桂花基因组学研究在国际上处于领先地位，我认为这个问题将很快得到解决。桂花属于十字花科。字花科植物包括模型植物拟南芥和许多具有遗传和形态多样性的物种。年来，中国科学家为十字花科植物特别是桉树的基因组学研究做出了杰出贡献，并积累了丰富的基因组测序数据[25-29]。2000年，拟南芥基因组国际合作联盟完成了拟南芥完整基因组的测序和分析。Suite au développement rapide de la recherche en génomique fonctionnelle d'Arabidopsis， il fournit un grand nombre d'informations pratiques et de méthodes de recherche aux scientifiques de divers pays pour étudier la fonction des gènes des plantes et l'amélioration de la génétique des plantes cultivées. Comment utiliser les résultats de recherche pertinents d’Arabidopsis au service de l’étude d’Osmanthus fragrans est une question très significative. Le développement de la génomique comparative nous fournit une bonne idée et une bonne méthode. Deux plantes ayant des ancêtres communs proches， dont les génomes avec des différences d'espèce sont évolués à partir du génome ancestral， plus les deux organismes sont proches du stade évolutif， plus leur corrélation génomique est élevée. S'il existe des liens de parenté entre organismes， leur génome présentera une colinéarité， c'est-à-dire que la séquence du gène est partiellement ou totalement conservée. De cette manière， la séquence codante génomique et l'homologie structurale peuvent être utilisées pour cartographier les gènes de l'autre génome grâce aux informations de cartographie du génome connu， révélant ainsi la fonction potentielle du gène et la structure interne du génome [29]. La couleur jaune et orange des feuilles internes de l'osmanthus fragrans est due à l'accumulation de caroténoïdes. La voie de synthèse et le réseau de régulation moléculaire sont similaires à ceux d'Arabidopsis thaliana. Le grand gène candidat au coeur orange osmanthus， BrCRTISO， présente une structure et une fonction similaires à celles d’Arabidopsis thaliana et de la tomate CRTISO. Selon les informations sur la structure et la fonction d'Arabidopsis thaliana et de la tomate CRTISO， le gène contrôlant le coeur rouge d'Osmanthus fragrans peut être obtenu. Nos travaux de recherche le prouvent. Grâce à l’analyse colinéaire avec les gènes d’Arabidopsis thaliana， les gènes clés candidats liés aux traits agronomiques importants d’Osmanthus fragrans L. ont été découverts et clonés， ce qui est l’un des moyens rapides et efficaces de procéder à la sélection moléculaire d’Osmanthus fragrans L. L'utilisation de marqueurs moléculaires et morphologiques pour la polymérisation de plusieurs gènes d'excellence est une méthode efficace pour innover en matériel génétique et raccourcir le processus de sélection. Lors de l’utilisation de marqueurs moléculaires pour aider à la création d’un excellent germoplasme d’osmanthus à cœur rouge orangé， nous portons une attention particulière à la sélection de caractères tels que la maturité précoce et les petites et moyennes feuilles. Avec l'amélioration du niveau de vie et le développement rapide des légumes de contre-saison， les boules de feuilles de petite et moyenne taille， la maturité précoce， le bon goût et la bonne qualité de l'apparence sont devenus les traits caractéristiques de la future sélection d'osmanthus de grande taille. Dans la pratique de la sélection， nous tenons compte de tous les facteurs susmentionnés et， enfin， réduisons la sélection de nouvelles variétés de 5 à 10 ans à 3 ans et demi， résistantes à la maladie et à un rendement élevé， tout en offrant un bel aspect.
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东省桂花的主要产地之一，具有悠久的栽培和种质资源传统，其中包括胶东桂花，在国内外都广为人知。受济南人民爱戴的德州乡子的鲜明特色。旺达桂花等[2]。着中国农业部门结构的调整和保护区蔬菜的发展，第一季度大桂花的供应量发生了重大变化。着人口生活水平的不断提高，将更加注重大桂花的品质，即形状，大小，颜色，营养，口味和风味以及指标。污染。费者欣赏桔红色的桂花，因为它们色泽鲜艳，桂花树价格胡萝卜素和其他维生素含量丰富，营养价值高，口感好。本用橙红色心培育的桂花较早开始，并允许种植优良品种。是，在中国，日本的红桂花的种子价格昂贵，不能抵抗病毒疾病，并且经常在受灾严重的地区和多年中，很难获得高而稳定的产量。此，培育适合在山东等地种植的高病毒性疾病，晚疫病和软腐病的桔红色心型桂花新品种尤为重要。到他们的种子[3]。对上述问题，自2002年以来，研究小组已开始收集和鉴定包含桔红色心脏的桂花资源，以研究心脏性状的遗传特征。2007年到2010年，我们扩大了育种资源，将杂交组合与分子标记辅助育种技术相结合，并选择了新品种的橙红色心形桂花“天正橙65”，适合春秋季播种。色橙子62“ 2014年”“天真橙红色62”成为泰安市岱岳区的参考产品（品牌注册号：）。过了北京市和北京市农作物品种审定委员会的审查和评估，2016年“天珍橙红65”被省农作物品种审定委员会批准。东。
红心桔红桂花：北京桔红心，红抗-1，长颜橙宝，沉萌桔红心，沉石桔红心.Ostras桂花心红桔心：橙色08410， 14-490、1480、14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-277、14-662、14-669百辛（或黄辛），桂花的优良杂交种：日本汉秀，金典纯王，开春和霞阳白心（或黄心），纯桂花纯线：新福08410、14-401、663、1466、1469、1505、1510、1 720，堆积锥电阻2。合组合（14-401 x 14-490）及其隔离F2中的种群。桂花的叶子中提取基因组DNA，将液氮冷冻并快速研磨，然后使用快速基因组DNA提取系统（Tiangen Biochemical Technology Co.，Ltd）提取。DNA）的检测通过在1％琼脂糖凝胶上的电泳进行。取总RNA，并从最后一个鳞茎的鳞茎中反转录，以提取总RNA。用TRNzol-A +试剂盒（Tiangen Biochemical Technology Co.，Ltd.）进行RNA提取，方法参考说明书。据TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit和gDNA Eraser产品说明书进行反转录。PCR扩增反应体系（20μL）如下：2 x高保真PCR PCR 10μL，上游引物（10 mmol / L）0.5μL，下游引物（10 mmol / L）0.5μL ，CDNA模板1μL，ddH2O 8μL。PCR反应过程如下：94℃3分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，36个循环，72℃10分钟。SDS-PAGE上将PCR产物与电泳上样缓冲液混合，并将混合物在95°C下预变性10分钟。去4ul的污渍，并用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并在Sequi-Gen GT核酸电泳系统（Bio-Rad，USA）中电泳分离。极缓冲液为1x TBE，在电泳下以恒定的°C和55 W功率进行1小时，通过银染显影，照相并记录。物信息学分析在GenBank中对克隆的基因序列进行BLAST搜索，以发现其他物种中大桂花靶基因的同源序列。用DNAMAN 6.0软件比对不同物种的基因编码的氨基酸序列，并构建系统树。高效液相色谱法测定桂花中的β-胡萝卜素含量[5-7]。取约5.0克成熟，干净的桂花叶，切成薄片，将其放在三角形的气球中，与石油醚：丙酮（体积比为80:20）摇动，除去上清液并重复萃取直至萃取液为无色并将萃取液合并，转移至圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上蒸发至干，残余物用二氯甲烷溶液萃取，过滤并纯化。过凝胶装置。化的溶液用于HPLC分析。用Gilson高效液相色谱仪，色柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μm，流动相甲醇：乙腈（体积比为90:10），流速1.0 mL / min，检测波长450 M，进样量20μL。200至800 nm的波长下扫描PAD，桂花树价格以分析该物质的特征吸收峰。溶性固形物含量的测定基于“ NY / T 2637-2014水果和蔬菜中可溶性固形物含量的测定。光仪法（2015-1-1实施）”。谦及其合作者（2012）[4]和柯贵兰（2010）[1]研究了由分子标记和常规杂交辅助的选择性选择。普通桂花相比，桔红桂花的内叶为橙红色。割后，该切片暴露在阳光下，叶子的橙色很快得到改善。前的研究表明，桂花的内叶含有多种类胡萝卜素，例如番茄红素型复合物[5-7]。胡萝卜素通过类异戊二烯途径在植物中合成，并以黄色，橙红色和红色出现。
植物中，许多红橙色特征与类胡萝卜素异构酶有关。胡萝卜素异构酶CRTISO通过前番茄红素催化反式番茄红素的形成[9，10]。Park等人（2002年）[6]从拟南芥中分离了CRTISO基因，并分析了其功能。此，他们发现类胡萝卜素异构酶的缺失突变体主要积累前番茄红素和前抗生蛋白链菌素（7，9，9'-tris-顺-抗生蛋白链菌素）。Isaacson等人（2002年）[7]使用图谱克隆技术获得了橙红色番茄橘子基因，该基因编码类胡萝卜素异构酶CRTISO，而橘子突变体缺少CRTISO。致番茄中番茄红素和β-胡萝卜素的积累。实为橘红色。此，在筛选和控制大桂花橙心的关键候选基因时，我们首先选择了编码类胡萝卜素异构酶BrCRTISO的基因作为候选基因。外，与桂花相比，在露天切成橙红色的桂花叶子是黄色的。
考虑筛选和控制桂花橙大心形成的关键候选基因时，我们还应考虑控制黄心形成的关键基因。Galpaz等人（2006）[8]克隆了CrtR-b基因，该基因控制番茄中白花的形成，这是由编码β-胡萝卜素羟化酶的基因突变引起的。大桂花中，有三个CrtR-b成员，分别是BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3。类胡萝卜素代谢途径的基础上，我们选择了BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因作为筛选关键候选桂花基因的候选基因。桂花BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3不是控制叶片中红色核心形成的关键基因，2007年我们使用了番茄LsCrtR-b1的基因序列。
在GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索了由其编码的氨基酸序列及其EST和基因组序列。桂花中发现了三个CrtR-b（BrCrtR-b1）成员。BrCrtR-b2，BrCrtR-b3）。据上述信息，我们设计了引物，用于扩增BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因的cDNA序列。球的晚期，使用纯橙红色桂花亲本“ Orange 0840”和纯心桂花“ Xinfu 08410”扩增BrCrtR-b1，BrCrtR-b2，BrCrtR-b3 。因的cDNA序列。后，进一步扩增这三个基因的基因组序列。果表明，纯橙红心桂花亲本“ Orange 0840”和纯桂花白心“信福”之间，BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因的cDNA和基因组序列没有差异。08410”。得的BrCrtR-b1，BrCrtR-b2和BrCrtR-b3基因的cDNA和基因组序列与2011年出版的大桂花的基因组序列相同。11]我们使用了有关基因和蛋白质的信息Wang等人（2011）发表的BrCrtR-b3和BrCrtR-b2，BrCrtR-b3 [11]比较了桂花BrCrtR-b和番茄LsCrtR-b的氨基酸序列。1、2）。果表明，大桂花与番茄之间的CrtR-b氨基酸序列高度保守，一致性为75.11％。桂花BrCRTISO是控制球状红心形成的关键基因.2007年，我们使用了拟南芥AtCRTISO基因的序列（登录号AAF63149）及其在GenBank中编码的氨基酸序列（https： //www.ncbi.nlm.nih）。.gov（）搜索中，获得了相应的桂花EST序列信息（登录号EX023490，EX043675，EX040997，EX056774）。后将cDNA序列克隆到BrCRTISO基因的完整cDNA中。用DNAMAN软件对中华棉（使用Bra323539），拟南芥，番茄，水稻和矮牵牛进行了比较分析（图3和4）。果表明，BrCRTISO与AtCRTISO具有很强的同源性，氨基酸序列同一性达到88.63％，而BrCRTISO与OsCRTISO具有较低的同源性，并且该酸序列具有同一性。为70.65％。试材料扩增了BrCRISO基因的基因组序列和编码序列。果表明，BrCRISO基因的基因组序列和编码序列在“ Orange 0840”和“ Xinfu 08410”之间有显着差异。他种群验证结果表明，这种差异与红叶的心脏性状共隔离。此，我们假设大桂花BrCRTISO是控制橘红色心脏形成的关键基因。SNP和InDel分子标记与桂花叶的橙色心脏密切相关，分析了白色心脏和橙红色心脏的BrCRTISO基因序列，以及其他研究，并揭示了两者之间的较大序列差异。桂花。括大量的SNP和InDel。大量的SNP中，有7个SNP与橙色性状完全相关，但单个SNP（C952-T952）引起氨基酸突变（L318-F318）（图5）。外，使用F2杂种一代组，自然种群以及一些白心和橙心品种进行检测，发现SNP952与橙性状完全结合[12]。此，我们将SNP952作为分子标记，用于种质资源的选择和桂花新品种的培育。SNP952外，第一个内含子上的InDel（Bror-intron1）标记也已广泛用于新橙红色心脏的培养（图6）。标记位于BrCRTISO基因的第一个内含子上，其中橙红色心脏相对于白心脏有25个碱基的插入。标记物可用于快速，准确地识别大桂花遗传物质的不同资源是否具有橙红色心脏性状基因，并可以区分它们是纯合子还是杂合子[12]。有橙红色心脏的新桂花杂交种“洪志1号”具有抗霉变和软腐病的特性，并且具有优异的完整性状，但不具有抗病毒性疾病的能力。2007年，我们将高强度，高价值的百辛达桂花纯净的“抗2锥双重病”作为双交叉反应抗病毒的供体，然后使用了分子标记[橙红色心脏标记]。：Bror-intron1，SNP（C952-T952）； BRRV病毒疾病抗性标记：BrID10694，101309;耐热标记物：[BRRH]协助选择，转移了抗性，然后进行了几代的自我分离和筛选，从而获得了红橙心的10份纯净材料的新复制品（08462、08463、08468、08469 ，08471、08472、08475、08477、08480、08881）。些纯净的材料是自相容的，在野外对病毒性疾病的抵抗力很高，球坚硬，植物的形状及其结合能力都很好。珠的类型有：扣（浅绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（绿色的叶子），扣（浅绿色的叶子），扣（绿色的叶子），拥抱（浅绿色的叶子），带扣（绿色的叶子），带扣（绿色的叶子）。们还推出了杂交种“北京橙红心”，对病毒，霉菌和甜腐病具有高度抵抗力。
2007年，我们使用分子标记（抗软腐标记：BRS1，抗白叶枯病标记：BRDM2）来帮助选择技术，并进行了多代纯化，并自动纯化了橙红心。京（F1混合动力）。相容性（08427，08428，08431，08435，08436，08437，08451，08460）。8条自交不亲和的品系具有紧密的球形成，出色的植物类型和经济特性，良好的结合能力以及对各种疾病的抵抗力。的类型有：扣子（叶绿色），拥抱（浅绿色叶子），拥抱（叶绿色），扣子（叶子绿色），扣子（叶子绿色），拥抱（浅绿色叶子颜色），环（颜色深绿色的叶子），循环（深绿色的叶子颜色）。Bror-intron1-F / R是标记为InDel橙红色的Bror-intron1正向/反向引物。
过将个体与14-401 x 14-490及其F2代分开来验证了Bror-intron1标记。1-11是白色心脏个体，12-19是橙色心脏个体。的桂花品种（12-23）是橙红色的桂花品种[12]。年，第一个组合测试。试结果表明，08428×08468（“天镇橙红色65”）和08469×08460（“天镇橙红色62”）的组合效果很好。过在2010年春季和秋季以及2011年春季和秋季通过现场产品比较测试，字符搜索和抗病性鉴定，确定这两种出色的组合适合特征性品种。季和秋季种植红绿色。正橙65中的β-胡萝卜素含量达到26.163 mg / g总重，是普通桂花的11.15倍，而可溶性固形物含量高于北京新三号和九号。道很好。霉，软腐病旺盛，捆扎牢固，收获期长。2014年，我们将地理标志证明商标“ Tian'an Huangye Guihua”（商标注册号：）与“ Tianzhen Orange Red 62”一起注册。2015年，“天真橙红65”和“天真橙红62”通过了国家和北京地区农作物品种审定委员会的审查和评估，2016年通过了“天真橙红65”。山东省农作物品种审定委员会审定。证天正橙65的高度为33厘米，有一个拥抱，生长期为65天，单个球重1.5到2.0千克，净蔬菜率为71.1％。子是鲜橙色的（图7）。项为期三年的国家区域试验的结果如下。2012年：秋季早熟品种，平均生长期为55至60天，品种纯度高，叶捆牢固，病害抗病毒性强，发霉软腐，单产蔬菜净重为70，080.0 kg / hm2，对照使产量增加了13.8％，单产显着提高。2013年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为60天，品种纯度高，叶捆牢固，抗病力强，腐烂和发霉，与对照相比，植物净产量为60 396.0 kg / hm2，增幅为8.6％，增幅显着。2014年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为60天，品种纯度高，叶片坚硬，抗病毒，防霉，软腐病蔬菜净产量为65 934.0 kg / hm2，高于对照。9.3％，显着提高产量。Tianzhengzuhong 62株高42厘米，株型紧凑，环状，生长55-60天，一包重约2.5公斤，净菜率71.3％，深橘红色，极好的口味质量（图7）。项为期三年的国家区域试验的结果如下。2012年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为74.9天，品种纯度高，叶捆牢固，抗病毒性强，霉变和在软腐病中，蔬菜净产量为64 605.0 kg / hm2，高于对照。4.9％。2013年：秋季早熟品种，平均生长期为73.9天，品种纯度高，球形坚硬，高度抗病毒病，抗晚疫病和甜腐病，产量高净植物产量为59 161.5 kg / hm2，相比之下见证者的产量增加了6.3％。2014年：秋季和中期的早熟品种，平均生长期为74.1天，品种纯度高，叶包牢固，病害抗病毒性强，腐烂和发霉蔬菜的净产量为66 682.5 kg / hm2，比对照增加了10.5％。品种天正橘65，天正橘红色62的栽培技术天正橘65，天正橘红色62的大桂花品种为早熟品种，类似于早熟大桂花的常用栽培技术。季播种时，每日温度应不低于13°C。于生长季节短，秋季可根据市场时期分阶段播种，山东地区可从8月10日到9月2日播种，种植面积为6万至75000株/ hm2；如果大约是120，000株植物/ hm2，则可以用作玩偶。碗的使用老蟑螂应尽量避免十字花科作物，并有良好的灌溉条件，肥沃的土壤，施用足够的基础肥料，及时覆盖并及时控制各种有害生物如卷心菜蠕虫和小菜蛾。两个新的桔红色桂花品种是春季和秋季品种，由于其质量和商业质量，它们适合盆栽蔬菜销售和在超市出售，并且可以在市场上种植。东和中国其他类似的生态区域。花红橙色心因其内叶的鲜艳色彩而得名。据以前的文献，桂花有橙红色的心有两种来源：一种是在日本引入的[13]，另一种是通过大桂花与一种生物技术杂交获得的新遗传物质。色萝卜[5]。]。本最古老的橘红色桂花花也是由日本桂花遗传育种家获得的，他利用有性杂交来转移桂花的酞菁抗性。此，控制橙红色心脏的桂花中橙红色心脏的形成的关键基因来自橙红色萝卜。
前，对桂花叶片颜色组成和遗传选择的研究显示了以下进展：（1）选择和扩展了一组新的红桂花品种橙色，可以丰富桂花市场并满足蔬菜需求[13-16]； （2）在大桂花中，橙红色的心脏是隐性性状，由单个基因控制； （3）参照拟南芥，番茄和其他示范作物，逐渐确定的桂花叶带有橙红色的心。包中的类胡萝卜素含量很高，而橙色是多余的。弹内叶中的类胡萝卜素，例如番茄红素[5，17-19]； （4）仅在2012-2015年。过去的三年中，许多研究小组独立报告了橙红色心脏链接图谱的研究结果，以及通过卡克隆克隆橙红色心脏基因的研究结果[17-24]。管这些方法和研究结果是相互交叉且相似的，但它们都是独立完成的。制大型橘红色桂花的形成的关键候选基因编码类胡萝卜素异构酶（CRTISO），基因编号Bra031539，位于A09染色体末端。们的团队介绍了2017年橙心心脏发育的转录组图谱结果。据BrCRTISO基因，开发了新的InDel分子标记和新的SNP标记[12]。两种标记都用于育种实践，并取得了良好的效果。管先前的研究取得了长足的进步，但橙红色心脏形成的分子机制和应用已变得越来越清晰，但仍未解决问题：BrCRTISO是促成心脏发生的关键候选基因。制橘子桂花形成红色的心。据完全删除了“候选人”一词。前，中国的桂花基因组学研究在国际上处于领先地位，我认为这个问题将很快得到解决。桂花属于十字花科。字花科植物包括模型植物拟南芥和许多具有遗传和形态多样性的物种。年来，中国科学家为十字花科植物特别是桉树的基因组学研究做出了杰出贡献，并积累了丰富的基因组测序数据[25-29]。2000年，拟南芥基因组国际合作联盟完成了拟南芥完整基因组的测序和分析。Suite au développement rapide de la recherche en génomique fonctionnelle d'Arabidopsis， il fournit un grand nombre d'informations pratiques et de méthodes de recherche aux scientifiques de divers pays pour étudier la fonction des gènes des plantes et l'amélioration de la génétique des plantes cultivées. Comment utiliser les résultats de recherche pertinents d’Arabidopsis au service de l’étude d’Osmanthus fragrans est une question très significative. Le développement de la génomique comparative nous fournit une bonne idée et une bonne méthode. Deux plantes ayant des ancêtres communs proches， dont les génomes avec des différences d'espèce sont évolués à partir du génome ancestral， plus les deux organismes sont proches du stade évolutif， plus leur corrélation génomique est élevée. S'il existe des liens de parenté entre organismes， leur génome présentera une colinéarité， c'est-à-dire que la séquence du gène est partiellement ou totalement conservée. De cette manière， la séquence codante génomique et l'homologie structurale peuvent être utilisées pour cartographier les gènes de l'autre génome grâce aux informations de cartographie du génome connu， révélant ainsi la fonction potentielle du gène et la structure interne du génome [29]. La couleur jaune et orange des feuilles internes de l'osmanthus fragrans est due à l'accumulation de caroténoïdes. La voie de synthèse et le réseau de régulation moléculaire sont similaires à ceux d'Arabidopsis thaliana. Le grand gène candidat au coeur orange osmanthus， BrCRTISO， présente une structure et une fonction similaires à celles d’Arabidopsis thaliana et de la tomate CRTISO. Selon les informations sur la structure et la fonction d'Arabidopsis thaliana et de la tomate CRTISO， le gène contrôlant le coeur rouge d'Osmanthus fragrans peut être obtenu. Nos travaux de recherche le prouvent. Grâce à l’analyse colinéaire avec les gènes d’Arabidopsis thaliana， les gènes clés candidats liés aux traits agronomiques importants d’Osmanthus fragrans L. ont été découverts et clonés， ce qui est l’un des moyens rapides et efficaces de procéder à la sélection moléculaire d’Osmanthus fragrans L. L'utilisation de marqueurs moléculaires et morphologiques pour la polymérisation de plusieurs gènes d'excellence est une méthode efficace pour innover en matériel génétique et raccourcir le processus de sélection. Lors de l’utilisation de marqueurs moléculaires pour aider à la création d’un excellent germoplasme d’osmanthus à cœur rouge orangé， nous portons une attention particulière à la sélection de caractères tels que la maturité précoce et les petites et moyennes feuilles. Avec l'amélioration du niveau de vie et le développement rapide des légumes de contre-saison， les boules de feuilles de petite et moyenne taille， la maturité précoce， le bon goût et la bonne qualité de l'apparence sont devenus les traits caractéristiques de la future sélection d'osmanthus de grande taille. Dans la pratique de la sélection， nous tenons compte de tous les facteurs susmentionnés et， enfin， réduisons la sélection de nouvelles variétés de 5 à 10 ans à 3 ans et demi， résistantes à la maladie et à un rendement élevé， tout en offrant un bel aspect.
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