[桂花树价格]桂花光周期调节剂CCA1功能标记的差异分析与开发

　　在这项研究中，利用春季和秋季的光周期趋势确定了与桂花06-247和He102相关的两条系的光周期敏感性：06-247是日光敏感的，而He102是长。阳不敏感。用同源克隆技术，比较和分析了两种材料在光周期反应中CCA1关键调节子的全长cDNA序列，桂花树价格确定有两个6 bp的插入/缺失和编码区中有14个非同义SNP。包含552，556个氨基酸残基，其非同义SNP引起不同的氨基酸取代，两者之间的氨基酸序列差异主要位于蛋白质-蛋白质相互作用域和CCA1蛋白中间区域的C末端磷酸化。项研究开发出了一个共同的分子标记，可以区分两个6 bp的插入/缺失。结果为进一步研究CCA1在调节桂花光周期反应中的作用奠定了基础。于甘蓝型油菜L.ssp。

　　京地区对吸烟的抵抗力是必不可少的指标。搐后，桂花树价格它必然伴随开花。此，癫痫发作属于桂花开花途径的发育过程。花和模型植物拟南芥属于十字花科（芸苔属）。此，研究拟南芥开花途径的分子机制对于桂花的研究具有重要的价值。南芥开花途径的分子机制表明植物的开花受四个途径控制，即春化途径，光周期途径，自主途径和赤霉素途径[1]。花大，属于已有两年历史的太阳能植物，在秋季适应了气球的特性，并在第二年的春天开花并开花，因此除了明显的低温外，它还从营养生长到生殖生长。长的日照，春化和长时间的日照是导致桂花开花的主要环境因素[2]。桂花的生产实践中，春季的温度范围较高，经常出现，难以避免的冷泉作用，日照长度的变化呈现出稳定的趋势。着时间的推移而发展，这是一个稳定的环境因素。果，所选择的依赖于全天的长时间惊厥的生产比基于深夜的低温桂花​​的材料更加稳定，并且有望导致更大的桂花种质。臭。

　　动花光周期的调控途径涉及一个复杂的昼夜节律调控网络，包括两个具有高度同源性和同源性的转录因子CMA1和LHY或异二聚体。
　　合到目的基因启动子区域的相应元件起作用[3]。乏CCA1和LHY单个基因的突变体具有在几天之内早期收缩和开花的表型，可将光周期缩短2-3小时[4]。南芥中的CCA1含有663个氨基酸残基，N末端的第11至82个氨基酸残基是MYB结构域，负责与启动子元件结合[5]；氨基酸残基136-316被蛋白质二聚化。C端与负责蛋白质-蛋白质相互作用的部分相连，是磷酸化的调节区域，其中的丝氨酸残基是修饰磷酸化的潜在位点[6]。何影响这些关键功能域结构的氨基酸突变都可能影响CCA1的功能，进而影响其光周期反应。究人员在杨树，大麦和玉米植物中克隆了相应的CCA1 [7-9]，其分子进化表明它们在单子叶植物中高度保守，并且结合域是N末端核酸具有相似的氨基酸序列。度达到79％，关于同一物种遗传多样性的报道很少。这项研究中，从不同的光依赖性桂花材料中克隆了CCA1的全长cDNA。现在两者的编码区中存在两个插入/缺失突变，并且通过生物信息技术分析了氨基酸序列以区分两者。入/缺失突变的共性标记旨在为利用CCA1基因突变发展香桂抗性提供理论依据和替代标记。花桂花系06-247的自交系是可商购的日本桂花系F1的自交系。桂花线He102是当地品种“河南二宝头”的自分离线。周期敏感性试验是在2010年至2013年山东省农业科学院蔬菜花卉研究所的基础试验基础上进行的，并进行了系统管理。验1（全天）：2010年8月10日正常播种，常规田间管理，11月21日进行健康的母本植物收获，11月30日进行日光温室种植，实验2（全天）：2012年12月发芽和发芽28，播种于2013年3月7日的棚子里。验3（短日）：完成2013年6月收获的种子，将浸泡的种子和发芽的种子放在4°C的冰箱中放置40天。8月20日，将其播种在装有营养土壤的盆中（基本肥料：壤土：ver石= 1：1：1）。种材料种植5至10株植物。有常规的肥料和水管理试验都始终观察其生长趋势，记录芽期，初花期，并研究和测量茎高（茎短）。），例如余养军[10]和张德双[11]。用厘米（cm），并使用DPS软件进行显着性检验。cDNA的完整克隆和CCA1序列的分析当桂花幼苗到达第二片叶子和心脏阶段时，立即取出约1 g的叶子真组织，并通过研磨提取出完整的RNA。Trizol（Invitrogen目录号15596-026）。过反转录（Tiangen Kit KR104，并根据说明进行操作）合成了第一条cDNA链。据数据库中的CCA1参考序列，使用Primer Premier 5.0软件设计了基因特异性引物（pF1：5'-TCGAGTGGTTCTAGTTTCTCAATCG-3'，pR1：5A-AAGACTATGGACACTACACAGGC-3'）。BRAD，使用cdNA作为高保真模型。PCR扩增。PCR反应系统：5 x 10μLHF缓冲液，dNTP混合物（2.5 mmol / L）4μL，引物（10μmol/ L，下同）pF1 1μL，1μLpR1引物，高保真酶全金（北京TransStart FastPfu DNA聚合酶，AP221-01）1μL，1μL基质，ddH2O 32μL。PCR反应步骤：在95°C下预变性2分钟，在95°C下变性20秒，在60°C退火20秒，在72°C延伸90秒，35个循环，在72°延伸C持续5分钟。1％琼脂糖凝胶上进行电泳，确认1μLPCR产物和1μL钝端载体（pEasy-Blunt Gold，满量程，CB101-01）在室温（25°C）下经受特定目标带的作用。钟的连接反应。热激法转化感受态的Trans1-T1大肠杆菌细胞（北京全金，CD501-01），通过菌落PCR检测阳性克隆，并将阳性克隆送到北京华大基因有限公司用于序列验证。用DNAMAN软件进行序列分析。能标记的开发和应用针对两种材料的CCA1编码区的两个InDel差异，设计了特异性引物用于两端的PCR扩增。

　　物的序列为PF1：5'-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3'，PR1：5'-CAAGGGACTTCTATCTTTCATCATTCAT 3'； PF2：5'-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3'，PR2：5'-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3'。过6.0％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的产物，并用银染色。开发的香桂花材料已与已开发的品牌进行了测试，以检查该标记是否合格。周期敏感性调查的结果列于表1。验1和2表明，通常在春季春分之前（短日条件下）可以混合He102和06-247。分之前的低温足以实现春化，但是丘疹的持续时间很明显。于He102。He102的初始开花期在2月中旬之间，花蕾长约23 cm，这表明He102可以在短日条件下折叠并正常开花。材料被骨架化。花不依赖于长时间的阳光；并非是06-247，开花期是春分之后的3月下旬，此时的花蕾非常短，初始开花期的差异非常明显。外，基于对第一试验的现场观察，发现在06-247的开花期开始时花粉很少，并且人工辅助的授粉难以检测。表明每日光子的花粉存活率较低，因此有必要等到4月中旬，日照时间接近。午2点，其花粉可以正常发育。们可以看到06-247的开花取决于长日照。验3的结果还表明，在短日条件下（9月秋天之后），He102可以在春化后正常收缩并开花，而06-247可以区分花蕾，但是没有抽搐，花蕾无法打开。生球化。之，He102的丘疹，癫痫发作和开花不依赖于长时间的阳光照射，但是06-247的芽不依赖于长时间的阳光，而癫痫和开花应在以下条件下发生同一天。论：桂花的花芽分化（表现芽）和惊厥开花可由不同的基因控制，属于不同的农艺性状。过使用自然日照长度的变化，一两次和三至三项测试的组合可以有效地识别出大的桂花香味花长期对太阳的依赖性。于CCA1是拟南芥中调节光周期的关键转录因子，因此本研究使用同源克隆技术在两种材料中克隆了全长CCA1 cDNA（见图1）。序后，发现长日依赖06-247的抗扭材料的CCA1编码区长1659 bp，与碱基的Chifu-401序列完全同源。BRAD数据，是从独立的整天He102药敏性惊厥材料中得出的。CCA1编码区的长度为1，671 bp。

　　了后者中的两个6 bp插入以外，整个编码区中还有23个SNP（图2A），其中14个为非同义突变，导致不同氨基酸的取代突变（图2B）。计第一个编码产物包含552个氨基酸残基，而后者包含556个氨基酸，其分子量分别为60.14 kD和60.58 kD。206-247比较了He102的编码区序列CCA1（A）和氨基酸序列（B）。2显示了基于完整cDNA的氨基酸序列的推导。两个完整CCA1 cDNA之间的两个6 bp插入/缺失中，根据CGGAAG，第一个是t.329_330，而He102的CCA1蛋白的第112位氨基酸插入Gly和Ser的两个残基。二个是CAACAA中的t.1407_1408，它导致He102的CCA1在氨基酸469之后插入两个Gln（图2B）。

　　余的非同义突变导致不同氨基酸的替换，其中118 Pro> Thr，119 Gly> Cys，125 Glu> Gln，176 Asn> Lys，440 Ser> Ala，442 Ser> Ala，465 Lys> Gin ，467 Glu>赖氨酸。外，440 Ser> Ala，442 Ser> Ala，528 Ser> Asn，529 Asn> Ser参与丝氨酸的置换，并构成了潜在的磷酸化修饰位点。据拟南芥中CCA1结构域的分布特征，He102突变位点主要位于第113个氨基酸之后，主要位于蛋白-蛋白相互作用区和磷酸化修饰区。上述性质上具有较大差异的氨基酸取代突变可能在蛋白质-蛋白质相互作用域中，这可能影响CCA1空间折叠结构，而在第4个突变处C末端可能影响磷酸化修饰的位点。CCR-247和He102编码区的小片段插入/缺失大小仅为6 bp，一个靠近5'末端，另一个靠近3'末端。引物设计在突变区域两侧的保守区域中，扩增的片段在100至200 bp之间。
　　过在非变性6.0％聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测扩增的片段，结果示于图3A，表明为6.0％。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可区分6 bp的差异。3'端的标记物检测到了一些大的桂花资源（图3B）。图中可以看出，所形成的标记延伸带是清晰的，并且没有令人讨厌的干扰，并且适合于遗传物质资源的基因型筛选。
　　查。规模桂花种质抗性的创新是春季桂花选择的关键，正确评估和有效检测抗癫痫性与桂花的功效直接相关。痰遗传物质的创新。花惊厥的评估方法有多种，多数采用低温春化处理。估青春痘的时期以及初花期和开始时间。花期共同用作确定抗抽搐的标准[10，11]。在一定程度上增加了抗收缩特性QTL作图研究的复杂性，并且难以获得准确的定位结果。如，张磊[12]使用类似的方法来确定惊厥抵抗力，从而找到9个与收缩阻力有关的QTL，在镰仓[13]中确定了6个位置。些研究人员指出，光周期会影响一些桂花大花的开花。们还发现花蕾和抽搐是不一致的[14，15]，但是他们没有提出抽搐和开花的概念，这取决于长日，也取决于花蕾和抽搐。花是对吸烟的抵抗力。项研究首次揭示出06-247和He102（芽和抽搐）是两个独立的特征，为进一步分析和精确定位下一个抗收缩特性奠定了基础。二试验和三相试验的结合使得可以有效地确定桂花材料的收缩开花是否长期依赖于太阳，并且构成了依赖于漫长的一天的新的表型鉴定方法。然界中日照的持续时间是一个不断变化的环境因素，植物已经针对光周期的变化开发了复杂的调节机制。于拟南芥光周期诱导开花的调控机制，本研究从关键的光周期调控因子CCA1开始，并表明在蛋白质-蛋白质结合区存在氨基酸插入/缺失。06-247和He102 CCA1的磷酸化区域。换突变。可能会导致两种CCA1蛋白功能的差异，从而导致两种材料的光周期敏感性不同，即CCA1是光周期调节的关键功能基因。于小片段在编码区的插入/缺失的差异，本研究开发了一种共同的分子标记，可区分位于功能基因内并可能发挥作用的两个大型桂花品种。选下一种抗鼠疫的种质。性育种者的选择和抗击性的桂花新品种的性状是替代标记。
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