[桂花树价格]自我不相容性:四个没有气球的桂花的S型分子鉴定

　　使用针对SRK和SLG基因序列保守区设计的特异性引物，通过PCR扩增，克隆和测序，结合生物信息学分析方法，引入了四种进口的非气球桂花（Brassica campestris ssp Chinensis Makino）。相容材料的单倍型已经过分子鉴定。果表明，A1不相容物质中所含的S-位点基因序列与油菜双歧杆菌的相似度为98％。Capitata L.SLG-31（E值为0）；材料A2不兼容。A3包含I类和II类S类型，并且S站点处于混合状态。含在A4不相容材料中的S位点基因的序列与西兰花（西兰花BRICI B. brucoli BOI1单倍型蛋白质基因（B. oleracea L. var .. Italica Plenck））具有98％的序列相似性，并且该序列为99％。苔属（Brassica campestris L.）是十字花科（Brassica L.）的一种，原产于中国，具有悠久的栽培传统，其面积，面积和产量均居首位。菜作物非气球桂花，也被称为B. campestris L. ssp Chinensis Makino，主要分布在长江流域的中下游，其种植面积约为1/3。花地区的蔬菜总面积中有一半是典型的异花授粉作物，具有较高的杂种优势。交不亲和性的使用是桂花杂交制种技术之一。常用的杂种，主要基于不同的单倍型。
　　和力是通过对应来获得的，因此对于育种者来说，快速，准确地识别自交配型单倍型非常重要。前，通常采用开花中的异花授粉方法进行鉴定，操作过程复杂，效率低下，不准确。[1]快速准确地鉴定桂花和所携带的S型（由具有多个等位基因的多态S位基因遗传控制的细胞类型）的自我不相容性不仅可以加速自我-Membership。系和自动不相容谱系的选择过程使得有可能获得杂交组合的靶向制剂，提高选择效率并避免杂交。交不亲和是一种植物在长期进化过程中促进异花授粉，确保物种生存并保持其繁殖特性的现象。据不同的遗传控制，开花植物的自交不亲和特性可以大致分为两种：配子体不亲和性（SSI）和孢子性自交不亲和性（SSI）。

　　
　　入[2]。子体自交不亲和是植物界最常见的自交不亲和类型，而孢子自交不亲和性仅存在于十字花科植物，石竹科和菊科等植物中。苔属是十字形孢子体控制物种的代表：研究表明，芸苔属的自交不亲和性受S-基因座等位基因（S1，S2，...，Sn）的影响。对照中，桂花的自交不亲和性研究确定了100多个S单倍型[3，4]。前，对自我不相容机制的研究表明，自我不相容的发生是由花粉和柱头细胞之间的自我识别引起的，识别过程主要是代表特定的S单倍型受体的配对。体的识别机制，参与该识别过程的蛋白质主要包括：S基因座糖蛋白基因（SLG基因），S基因座受体激酶基因（SRK基因），花粉蛋白富含粘液半胱氨酸的蛋白质基因（SCR基因）。

　　中，SLG和SRK是表达柱头的蛋白质基因，SCR是花粉壁中存在的特定因子基因，并且三个紧密相关的基因参与了花粉和柱头之间的相互识别[5-7]。7]。着分子生物学技术的不断发展和对甘蓝型油菜自交不亲和性的深入研究，还鉴定了几种带有S单位的SLG，SRK和SCR基因序列。着DNA测序技术的飞速发展，通过生物信息学分析，桂花S型自交不亲和性的快速鉴定也成为可能。过与基因特异引物的PCR扩增，克隆，测序和生物信息学分析，在实验中使用了四种与桂花A1，A2，A3和A4不相容的进口材料的S-单倍型。SRK和SLG出版。行了分子鉴定，为小桂花杂交组合的授粉制备提供参考。气球状桂花A1，A2，A3和A4的自溶材料是从国外进口的，由武汉蔬菜科学研究所提供。心柱PCR产物回收试剂盒购自北京天根生化技术有限公司，pMD18-T支持物购自宝生物工程（大连）有限公司。DNA提取选择每种材料的幼叶，桂花树价格然后使用改良的CTAB采样方法提取4种测试材料的基因组DNA，并保存在-20°C以便使用。物的设计利用了Nishio等人设计的引物PS5和PS15报道的特异性引物。[8]扩增I类（S单倍型在花粉中占主导地位），SLG，P3和P4特异性引物是张爱芬设计的引物[9]扩增II类SRK基因（S-单倍型）。花粉表示）。物序列如表1所示。
　　物合成由上海圣工生物工程技术服务有限公司完成。4份基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL。94°C变性5分钟，94°C变性30秒，52°C变性30秒，72°C变性90秒，35个循环和72°C变性之前进行扩增程序。25℃下在100℃下干燥10分钟。1.0％琼脂糖凝胶上进行产物的电泳检测，并通过紫外凝胶成像系统照相。标片段的回收和克隆使用PCR产物回收试剂盒回收目标片段，将回收的DNA片段连接到pMD18-T载体中，并转化到可胜任大肠杆菌的大肠杆菌中。

　　白色斑点的筛选。行PCR鉴定。序和序列分析对于鉴定出的阳性克隆，对样品进行测序，每个样品鉴定2-3个阳性克隆，由上海胜工生物工程技术服务有限公司进行测序。用DNAstar软件进行序列分析，并通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线进行呼气分析。用S类S型SLG，PS5 + PS15基因特异性引物组合和II类SRK基因特异性引物组合对4种自相容的A1，A2，A3和A4材料进行PCR扩增P3 + P4结果如图1所示。图1所示，A1材料仅在PS5 + PS15引物组合中包含扩增产物，A4仅包含PS5 + PS15引物中的扩增产物。物P3 + P4的组合，以及A2和A3在2对引物扩增条件下具有特异性。队出现。面的结果表明，A1可以属于S类单元的I类，而A4属于II类单元S的类型。A2和A3的扩增结果表明，很可能在两种不相容的材料中包括两种类型的S单倍型，而在S位点包括一种杂合型，为了进一步验证上述结果，该片段从上述四种自身不相容的材料中扩增出的靶标分别被回收并连接至pMD18-T载体，并进行了大肠杆菌转化，并去除了阳性克隆进行序列测定。相容物质扩增产物的4拷贝DNA序列测试结果与NCBI登记的芸苔属核苷酸序列进行比对，以确定其S单倍型。过PS5 + PS15引物扩增出自我不相容的A1材料，并克隆并测序了1，桂花树价格356 bp的片段，并与甘蓝（B. oleracea L. var。Capitata L.）进行了比较。SLG-31（GenBank登录号AB054729.1）的相似度为98％（E值为0），序列覆盖率为94％。是，对于具有80％序列覆盖率的桂花S位蛋白1基因（GenBank登录号HM629338.1），其CDS序列的相似性达到99％（E值= 0）。
　　上结果表明，在更高的序列覆盖率的情况下，自相容材料A1的位点S基因序列与SLG-31具有高度相似性，并且该基因的S型桂花蛋白1属于。列相似度越高，序列覆盖率越低。此，为了准确识别其S单倍型，需要进一步的实验来验证它。过两对引物扩增A2不相容材料，包括1356 bp和1046 bp的特异性扩增条带。比对1，394bp序列后，回收了桂花链球菌的S-糖蛋白SLG-30基因（GenBank登录号D85217.1）和酞菁（B. rapa L. assifera Matzg）。SRK-30位点受体激酶基因序列（GenBank登录号AB054693.1）具有高度相似性，分别为99％和98％。
　　此，从根本上可以确定不兼容的材料包括S30单倍型。比对1059bp片段后，发现SRK-60和SLG-60基因覆盖率（GenBank登录号AB097116.1）的99％相似度为99％。比其他单倍型高得多。此可以确定该序列属于S60单倍型。此，基本上可以确定自相容性材料A2具有两种S类型的S30和S60，并且再次证明自相容性材料A2在S位点处于杂合状态。相容性A3也与A2材料相似，在I和II类的S型引物中扩增出相应的靶带，分别为1 356 bp和1，046 bp。两个序列的分析表明，在序列覆盖条件下，第一个和萝卜SGT-63（Raphanus sativus L.）基因（GenBank登录号EF056499.1）表现出99％的序列相似性。98％;具有花椰菜（B. oleracea，L。ar。Italica Plenck）的BOI1 SRK单倍型蛋白质基因（GenBank登录号JQ253785.1）具有98％的序列相似性和99％的序列覆盖率。％。以上结果可知，不相容物质A3在S位点是杂合的，自相容物质A4属于II类S单倍型，其结果为。其1046 bp片段的序列分析（图2）表明，自交配材料A4包含II S类位点基因序列及其自交。相容材料A3中S位点基因的序列相同，并且两种材料都必须包含相同类型的基因桂花S.桂花是典型的异花授粉培养，具有明显的杂种优势。
　　相容线的使用主要是通过映射自相容线的不同单倍型来实现的。此，对于育种者，获得了自我不相容单倍型的速度。别至关重要。前，有许多方法可以识别自身不相容性，包括：亲和指数法[10]，荧光显微镜[11]，等电聚焦电泳[12]，免疫分析[13]。通过RFLP-PCR的分子鉴定方法（限制性片段长度多态性-聚合酶链反应）[9]。了精确识别所研究材料上的单倍型S，上述方法难以实施。着DNA测序技术的飞速发展和公开报道的单倍型S序列数量的增加，PCR扩增后通过直接测序来确定自身不相容材料的S倍型成为可能。分子鉴定方法可以快速鉴定植物自身不相容性的单倍型，从而大大提高了检测效率，避免了杂交，具有广阔的应用前景。这项研究中，使用从SLG和SRK基因的保守序列设计的引物进行了非气球桂花的4型分子鉴定，从而可以鉴定S单倍型。4种材料。我不相容的A2和A3物质同时发生I类和II类S单倍型，这一现象在先前的研究中也已有报道。爱芬[9]鉴定了11种非主要桂花材料的S型，发现11种材料同时扩增了I类和II类两种类型，并且自我不相容的S位点是杂合的。种现象也出现在桂花的一些自交不亲和的地方，这可能是由于它的自交不亲和，使其难以自给，而外来花粉在侵入时极易侵入。制。于很难区分表型上的杂合基因位点[14]，因此许多亲本材料在S位点不是完全纯合的，因此，在引入新的不相容遗传材料资源和选择时对于不相容的材料，我们必须严格防止外来花粉的入侵，并采取隔离措施以确保纯度。时，可以通过分子技术快速实现其S单元的类型。别，从而提高了不相容材料系统的选择和关联效率。
　　外，在鉴定桂花自交不亲和材料的S单倍型的过程中，发现大多数序列与其他十字花科作物如卷心菜和萝卜一起测序。包括的S位点基因序列具有极高的相似性。如，对A3自交不亲和材料中1，356-bp片段的序列分析表明，Rad S位点糖蛋白A3和SGT-63基因（GenBank登录号EF056499.1）具有序列覆盖率为98％。此条件下，序列相似性为99％，A4自相容材料中包含的S基因序列与蓝色和白色菜单PLoid BOI1蛋白基因（d GenBank访问JQ253785.1）。盖率为99％。十字花科植物的交叉亲和力研究中，基因组比较研究发现西兰花和萝卜的S位点基因非常相似：桂花的S46，S47和S8单倍型以及这三个物种S7，S12和S32单倍型在SRK基因上都显示出极大的相似性，种间杂交表明它们也具有相同的自相容性识别特异性[15]。

　　
　　同的萝卜（Raphanus L.）还具有与栎属（Quercus）属高度同源的基因SLG，SRK和SP11，并且不能通过核酸序列的聚类分析来分离。些数据表明，S-spot基因的多态性是在芸苔和板蓝根分化为不同物种之前形成的，并且很可能来自共同祖先[16]。这项研究中，从基因组序列分析的结果得出的四种自交不亲和材料中包含的四种S-单倍型显示出与甘蓝和萝卜的某些S-位点基因序列高度相似，并表明识别的相同特异性仍有待实验确认。
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