[桂花树价格]利用正交设计优化ESTSSR反应体系鉴定桂花的纯度

　　以三株大型桂花杂种及其亲本为材料，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，采用正交设计优化了Mg2 +，dNTPs，引物， DNA模板和Taq酶。花纯度的EST-SSR检测系统包含：3.0 mmol.L-1 MgCl 2、400μmol.L-1dNTP，0.20μmol·L-1SSR，4 ng的引物。DNA模板和0.05 U在10μL反应系统中Taq酶。用此优化系统，在单个植物上测试了三个单独的桂花杂种，并为每种杂种选择了140个菌株进行纯度鉴定。果表明，扩增条带类型清晰稳定，纯度检测结果与现场测试结果基本吻合，可用于后续的分子标记研究。花种子的纯度。蓝型油菜（Brassica campestris L.）是芸苔属的一年生植物，原产于地中海沿岸和中国，其栽培面积和消费量是中国所有蔬菜中的第一。
　　桂花杂交种的生产和销售过程中，建立以质量检测为中心的优良选育和种子管理系统，对桂花的稳定和推广具有重要作用。良品种。前，用于鉴定大型桂花杂种纯度的直接和可靠的方法是种植和田间鉴定，但是该方法对环境敏感，时间长且占用人。壤消耗劳动。定种子纯度的理想技术不仅准确可靠，而且简单，快速，经济，实用：这是鉴定种子纯度和发展趋势的营销原则。项技术。年来，植物分子生物学的迅速发展导致了在分子水平上对培养物的分析。DNA分子标记技术在生物遗传多样性分析中更有效地识别不同甚至密切相关的基因型，已成为构建指纹多样性和鉴定指纹的更理想的方法。子纯度。SSR（简单序列重复）是一个简单的序列重复，也称为微卫星，它是由几个核苷酸（通常为1-6个）作为重复单元组成的串联重复[1-2]。广泛分布在真核生物的基因组中，并具有每种物种特有的侧翼序列，其多态性高于其他DNA分子标记。于它的丰度，可重复性，高可靠性，共有的遗传性以及易于分析，因此可用于有效，准确地检测生物体中的遗传变异。着功能基因组学的飞速发展，GenBank已经积累了许多重要物种的大量EST序列，这些序列易于获得且无成本，成为SSR标记开发的重要来源。EST的单序列重复标记（SSR）技术不仅保留了SSR标记技术的所有优点，而且在便利性，低成本和高效率方面突出了其优势[3-4 ]。使用EST-SSR技术对该植物的EST-SSR反应系统进行优化，以建立一套适用于该物种的EST-SSR检测系统。前，EST-SSR技术已用于大型桂花品种的鉴定和遗传物质资源的分析[5]，但关于EST检测系统的报道很少。
　　SSR及其鉴定桂花纯度的优化方法。这项研究中，从影响PCR扩增的关键因素对EST-SSR系统进行了优化，以建立稳定，准确的EST-SSR检测系统来鉴定桂花的纯度。L.，为研究遗传物质资源，对桂花进行鉴定和鉴定。因定位和其他研究的基础就是基础。

　　
　　试材料为3种大型桂花商业杂种及其亲本，表1列出了具体名称。因组DNA的提取使用M. Somma及其合作者提出的CTAB方法。每个品种中随机挑选200个均匀完整的种子，使其萌发并在光线下生长，在真叶生长后，收集140株幼苗用于DNA提取。
　　用NanoDrop分光光度计ND-1000核酸蛋白质分析仪和1.5％琼脂糖凝胶电泳测量提取的DNA的浓度和质量，然后稀释。50 ng·μL-1的浓度保存在-20°C直至使用。EST-SSR基因座选择基于先前的研究[4]，桂花树价格选择高多态性BC1基因座作为优化对象。位点可用于鉴定3个大型桂花杂种的纯度，通过不同差异的特征带，找到具有互补亲本带类型的杂种特征带的引物，并确定BC1引物可以处理同时开3朵桂花。经鉴定出杂种的纯度。2详细列出了该位点的信息和PCR引物序列。大桂花2号及其亲本为实验材料，对SSR-PCR反应体系进行了优化，桂花树价格开发了BC1引物。择Mg2 +浓度，dNTP，引物浓度和基质浓度，并应用于L16正交测试规程（45）（表3）。Taq DNA聚合酶的筛选系数为4，以确定最佳组合，每种组合对应于10μL反应系统。表中的变量外，每种处理均包含1μL10X PCR缓冲液。（Mg2 +免费），加入10μLddH2O并进行2次重复。SSR-PCR扩增程序是在ABI Veriti梯度PCR仪上进行的，其中在94°C下预变性5分钟，在94°C变性60秒，在54°C退火45秒，于72°C延伸45秒，进行35个循环，并于72°C延伸。PCR扩增产物存储在-20℃的冰箱中。非变性的8％聚丙烯酰胺凝胶上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳仪使用BIO-RAD 3000高压电泳仪，电泳条件为：100 V持续10 min，然后调节至250 V持续30 min，负载为1μL。染：染色8分钟（加入6 mL的10％硝酸银溶液，准备使用），冲洗（不超过15 s），显影（加入9 g氢氧化钠，使用前添加3 mL甲醛溶液），完成，清洁，扫描图像并记录结果。用优化的系统测试了反应系统的稳定性：确定了三个大型桂花杂种的可用BC1引物的纯度，为每个品种选择了一种植物，结果是与现场测试结果相比。

　　较以确定优化系统的可用性，稳定性和准确性。DNA提取是PCR的基本步骤和环节，其质量与实验的成败直接相关。该实验中，使用增强的CTAB方法提取和纯化更高质量的基因组DNA（图1）：主条带清晰，没有残留带，不受杂质和RNA的干扰，并且纯度高，可用于桂花的纯度。-优化SSR检测系统。旦按照表3中所述的16种处理进行了EST-SSR反应，则将获得的产物进行8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果示于图4。图2中可以看出，在16种处理中可以扩增产物，并且在2、7、12、13和14种处理的主带位置上发生高的非特异性带干扰；处理5、6和9。敏度10、11和15太高，特征带很深并且非特异性扩增很明显：处理16在处理1、4、8和16中的灵敏度为相对适中，非特异性谱带较小，主谱带清晰可见。

　　究最佳组合。此，此组合中使用的PCR反应系统是最佳系统，它包含3.0 mmol.L-1 MgCl 2、400μmol.L-1dNTP，0.20μmol·L-1的SSR引物和在10μL反应系统中加入4 ng模板DNA。0.05 U Taq酶。3种桂花杂种进行了随机育苗试验，从每株杂种中提取了140株菌株，并用BC1引物鉴定了EST-SSR分子标记的纯度。度鉴定的结果如图3至5所示。桂花'Autumn Green 75'不是纯单株3，不纯单株的数量为4、18、26，其纯度为1。子是97.85％;带有“秋天绿色60”气味的大型桂花，单个不纯植物2，单个不纯植物，数量为1.16，种子的纯度为98.57％，桂花大香，“金白56”，不纯的单株植物3，不纯的单株植物的数目为9、10、26，种子的纯度为97.85％。得的纯度结果与传统的现场纯度鉴定结果基本一致，从而确保了所选引物的可靠性和稳定性并建立了系统。前，种子纯度鉴定技术已在分子水平上逐步发展，以满足商业育种的需求，近年来，GenBank和不断更新和完善SSR，EST-SSR引物设计软件。记技术显示出其高多态性，高特异性和共性，但由于其具有以下优点：易于获取，数量众多，因此也被广泛用于水稻，小麦和大麦。息，低成本和高效率。萄，玉米，甘蔗和其他植物的分子结合图谱和遗传多样性[6-10]。据正交设计优化了EST-SSR反应体系：反应体系中的Mg2 +浓度，dNTP，引物浓度，模板浓度和Taq DNA聚合酶均影响反应结果。
　　应，并考虑到单因素变量。信，引物浓度越高，扩增产物的浓度越高，但非特异性扩增，引物二聚体甚至碱基错配的可能性越大：基质浓度DNA太高，可能过早消耗。发，引起底部延伸或无规终止，分散或变差，但通常，基质的量不会过多或过小，对反应体系的影响不是很明显， Taq酶浓度会影响扩增效率，酶浓度过高会导致扩增不兼容。于多因素变量，在给定过程中很难确定单个因素对整体响应的影响，因为因素，消耗和竞争之间存在细微的组合，例如Taq。的活性取决于Mg2 +的浓度，而dNTPs是PCR反应的重要底物，不足时会直接影响PCR反应的过程，但可以与DNA结合。Mg2 +含量过高时会与Taq酶竞争。Mg2 +降低了Taq酶和扩增产物的活性，因此Mg2 +和dNTP浓度的变化对扩增的最终结果影响很大。

　　此，在实际操作中，必须根据测试条件进行选择或调整[11-13]。据正交设计优化了桂花的EST-SSR反应体系，以获得具有清晰，稳定和非特异性扩增的单条带，用于测定纯度。交测试设计是研究多因素和多层次因素的一种设计方法。根据正交性选择完整测试的代表点，这些代表点具有平衡的分散性和均匀性。别特征可以有效地解决理论上需要的试验数量和现场试验数量之间的矛盾。学提高了实验效率，摒弃了桂花纯度鉴定的优化体系，为进一步研究桂花的纯度奠定了基础。花的分子纯度
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