[桂花树价格]桂花绿紫色花叶病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

　　将黄瓜绿色斑点花叶病毒（CGMMV）外壳蛋白基因克隆到原核表达载体pEHISTEV中，得到pEHISTEV-CGMMV-CP，并将其转化为E大肠杆菌Rosetta和IPTG诱导。得了分子量为19.5kD的CGMMV CP融合蛋白。过用糊化诱导的CMGMV CP免疫兔来制备抗血清。Western印迹试验表明，所制备的抗血清可以与CMGMV CP特异性免疫反应，并且不与烟草花叶病毒（TMV）反应。过琼脂双扩散试验，制备的抗血清的滴度为1：16，ELISA的滴度为1：1024。血清具有高度特异性，具有很高的滴度，可用于CGMMV的检测。瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）属于烟草花叶病毒属（Virgaviridae）[1]。病毒主要侵染葫芦科作物，如黄瓜，黄瓜，柠檬，黄瓜，丝瓜，苦瓜和柑桔，常常造成重大的经济损失。失。外，CMGMV还感染苜蓿植物，如Chen色藜（Chenopodium amaranticolor）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）模型植物[2-7]。CGMMV颗粒呈直茎状，约300 nm x 18 nm，基因组为阳性正单链RNA，全长约6，400个核苷酸，主要由非翻译区（UTR）组成在两端，中间四个。放阅读框（ORF），其包含编码17.3 kD（CP）包膜蛋白的ORF4 [8]。CGMMV主要通过田间汁液的接触传播，也可以通过种子传播[9]。植无病毒的幼苗并及早发现是预防和控制CGMMV的关键。
　　血清学方法具有以下特点：使用简便，灵敏度高，能够检测大量样品。被广泛用于瓜类病毒疾病的检测。这项研究中，质粒pEHISTEV用于构建CGMMV济南分离株CP基因的原核表达载体，CGMMV外壳蛋白在大肠杆菌中有强力表达，抗血清为用这种抗原制备的，可用于检测CMGMV。济南市济阳县采集了西瓜叶样本（感染了CGMMV）[10]。化的CGMMV和烟草花叶病毒（TMV）分别保存在本氏烟草和正常烟草上。核表达载体pEHISTEV是由英国圣安德鲁斯大学的刘焕庭教授引入的，而E.的DH5α株则是由E. Coli和Rosetta大肠杆菌在我们的实验室中是保守的：逆转录酶，Taq DNA聚合酶，限制性核酸内切酶（EcoRI，XhoI），T4 DNA连接酶，dNTP，无RNase的水等。
　　TaKaRa购买； RNeasy Plant Mini Kit购自Qiagen； DNA回收试剂盒，质粒微量试剂试剂盒，DL2000 Plus DNA分子量标准品和蛋白质分子量标准品购自北京全金公司。他生化试剂和标准化学试剂在加拿大进口或分析。RNeasy Plant Mini Kit提取西瓜叶中的总RNA，并使用CGMMV CP基因5'-CCCTCGAGCTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCT-3'（用Xho I限制性酶切位点加下划线）的下游引物进行逆转录。用上游CP基因引物5'-CGGAATTCATGACTACGCC 3'（带下划线的部分是EcoRI切割位点），对下游引物进行PCR以扩增CMGMV CP基因。过在低熔点琼脂糖凝胶上电泳回收PCR产物，用EcoRI和XhoI消化，桂花树价格并在4°C下与相同的酶处理过的pEHISTEV载体连接过夜。pEHISTEV-CGMMV-CP连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，并对PCR扩增的阳性克隆进行测序，以确保序列正确。PEHISTEV-CGMMV-CP被转化到Rosetta大肠杆菌中。去单个菌落并接种在5ml LB液体培养基（含有50μg/ ml卡那霉素）中，在37℃下活化过夜，并在1∶100至20ml的含液体培养基中稀释。那霉素第二天。37°C，220 rpm的培养基中培养3小时（OD600 0.4-0.6），IPTG的终浓度为0.2 mmol / L，在25°C，220 rpm的条件下继续生长分钟和5小时。心收集细胞，加入适量的TE溶液（pH 8.0），摇匀并悬浮，加入等体积的2x SDS上样缓冲液，在100°C下煮沸5分钟，冷冻5分钟以12，000 rpm离心10分钟。行SDS-PAGE。

　　核表达产物在12％SDS PAGE上进行电泳，用预冷却到0.25 mol / L和1 mmol / L DTT的KCl染色，并含有蛋白质的条带。下感兴趣的物质并以1：1（W / V）至0.9的比例添加。盐溶液的百分比在预冷的研钵中研磨。过加入等体积的不完全弗氏佐剂将所得靶蛋白乳化后，在背部和皮下多次注射免疫兔，并免疫小鼠3次。次免疫剂量为1 mg，然后每10天加强免疫0.6 mg，并在7天后从耳静脉采血确定抗血清滴度。后一次免疫。抗血清添加到0.02％叠氮化钠中，并保存在-20°C下。estern Blotting [11]制备的抗血清与CGMMV和相同的TMV反应以评估抗血清。
　　血清的特异性。过琼脂凝胶免疫扩散和PCR-ELISA确定抗血清的效价[12]。制备的抗血清以1:20至1：213的梯度稀释，在ELISA中，显色后用酶标仪读取405 nm处的OD值，待测样品-空白读数/ H（阴性样品-空白读数）≥3被认为是阳性反应。续稀释感染CGMMV的中华按蚊叶片液（1：2，1：4，4，1：8，1:16，1:32，1:64，1：128，1：256转移测定法检测抗血清的敏感性。用CGMMV CP基因的上游和下游引物进行RT-PCR扩增，以获得486bp的片段。收并纯化PCR产物，用EcoRI和XhoI消化，并与相同的酶处理的pEHISTEV载体连接以获得重组质粒pEHISTEV-CGMMV-CP。过PCR鉴定（图1），并通过测序确认其序列和阅读框。PEHISTEV-CGMMV-CP转化为0.2 mmol / L IPTG诱导的大肠杆菌Rosetta，并在SDS-PAGE上电泳。果显示存在接近19.5kD的蛋白条带（图2），该蛋白条带是通过CGMMV CP基因与His-Tag基因的融合以及TEV蛋白酶在其上的切割位点的融合而表达的。pEHISTEV载体。果与预期一致，表明CMGMV PC在大肠杆菌中正确表达。Western印迹分析后，在装有pEHISTEV-CGMMV-CP液体的泳道中出现了分子量为19.5 kD的蛋白带，但在装有空载体pEHISTEV的泳道中未出现（图3），这表明制备的抗血清对原核表达载体pEHISTEV-CGMMV-CP表达的CMGMV CP具有特异性免疫应答。血清与感染CGMMV的本氏烟草叶提取物发生特异性反应（图4），但不与健康的本氏烟草叶提取物和相同的TMV反应，表明制备的抗血清具有很好的特异性。别琼脂凝胶免疫扩散结果显示抗血清滴度为1:16，而ACP-ELISA试验显示抗血清滴度为1：1024。estern Blotting结果显示当将患病汁液稀释2至16倍时，NC膜上出现黑带。患病汁液稀释128倍时，观察到更明显的条带，表明血清具有更高的浓度。敏度（图5）。M：蛋白质的分子量标准； 1至8：易感染本氏烟草叶汁的梯度稀释（1：2，1：4，4，1：8，1:16，1:32，1:64，1：128，1）：256） ; 9：健康的便当烟汁。化病毒制备的抗血清中通常含有宿主蛋白的抗体易发生假阳性反应[13]。

　　
　　外，某些病毒的患病组织含量低，并且难以获得大量的高纯度病毒。过使用其中原核细胞表达病毒基因作为抗原的产品，可以获得高度特异性的抗血清，桂花树价格解决了上述问题。TMV和CGMMV属于烟草花叶病毒属，其血清易发生交叉反应[14]。研究以在大肠杆菌中表达的CP抗原为抗原，制备了CMGMV抗血清，该血清具有较高的滴度和特异性，可用于琼脂凝胶免疫扩散，ELISA和Western Blotting。可以快速检测CGMMV和病毒。致病机制的研究提供了条件。
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