[桂花树价格]疫霉菌诱导的桂花提取物转录因子的筛选
时间：2019/11/25 6:32:27 浏览量：
桂花易感品种'B80'被用作材料，并用RT-qPCR表达了桂花基因组中的54个CsWRKY基因，并在感染后用疫霉菌和水杨酸进行了分析。SA）和茉莉疫霉致病性（或抑制）基因表达是通过用乙酸甲酯（MeJA）处理以及与该疾病可能相关的信号通路进行检测的已经分析过了。果显示，疫霉菌上调了15个CsWRKY基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44、46、48、52和56），仅CsWRKY6上调。被疫霉菌下调。
SA和MeJA的作用下，SA诱导了CsWRKY的7个基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56），SA和MeJA共同诱导了CsWRKY44的基因，而CsWRKY6由MeJA下调，抑制，假设有7个基因（7）。CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）可以通过AS介导的信号通路调节植物对病原体的反应; CsWRKY6可以通过Y介导的信号通路调节植物防御反应。CsWRKY44可能同时参与AS和与疾病抗性相关的AJ介导的信号通路。花是重要的蔬菜作物。南地区受到极端温度和高湿度的影响。花鼠疫的病害很严重，但是由于缺乏高抗性的材料，因此对燃烧的抵抗力很慢，并且研究了对桂花的抵抗力的遗产。达森等[1]也认为，以生物技术为主要手段的抗性转移研究的发展对当前对甜瓜病抗性的选择至关重要。录因子WRKY来源于早期的真核生物，广泛分布于高等植物中。是植物中最大的转录因子家族之一[2]，并以约60个氨基酸的保守WRKY域命名。守的WRKYGQK的七个氨基酸残基在氨基-N（末端）末端附近构成该结构域的中心序列[3]。WRKY转录因子家族是一个很大的基因家族。前，已在稻米[4]，拟南芥74 [5]，玉米136 [6]，大豆133 [7]和大白菜145 [8]中鉴定出至少109个WRKY成员。薯中存在最古老的WRKY SPF1转录因子，其生物学功能是调节糖信号通路的建立[9]。后的研究表明，WRKY转录因子在植物对生物和非生物胁迫的防御反应以及植物花粉发育[10]，种子成熟和发芽[11]中起着至关重要的作用。
]，植物叶片的衰老[12]。生理过程。植物对生物胁迫的响应中，转录因子基因WRKY主要参与各种抗性反应，从基于植物的免疫力到抗性，并通过调节来影响植物病原体多种途径和多种水平的信号转导途径来抵抗疾病。理反应在植物与病毒，细菌，真菌，线虫和昆虫的相互作用中起着重要作用[13]。Dong等[14]分析了72个拟南芥WRKY基因的表达模式，发现其中的49个是由含有SA或SA的病原体诱导的。水稻上，稻瘟病菌诱导后的45个WRKY基因中有15个上调，而12个稻瘟病单胞菌同时诱导，其信号转导表明OsWRKY45和OsWRKY62受到AS的影响。达诱导被上调，JAs上调了OsWRKY10，OsWRKY82和OsWRKY85，SA和JA表达同时上调了OsWRKY30和OsWRKY83 [15]。了拟南芥和水稻等模型植物之外，随后的研究表明，诸如棉花[16]，油菜籽[17]和大麦[18]等作物，以及诸如胡椒的蔬菜作物[19-20]和大白菜[8]。显示WRKY转录因子对病原体诱导的反应有反应。花基因组测序完成后，Ling等[21]在寻找桂花基因组并分析55种冷胁迫下的表达后，发现了55个CsWRKY转录因子基因。干旱和高盐浓度。前，国内外尚无有关桂花抗病反应的WRKY转录因子的报道。研究使用RT-qPCR技术分析并筛选了桂花中CsWRKY基因的表达。析与疾病相关的可能信号传导途径，并为研究CsWRKY在具有愉悦气味的桂花疾病防御反应中的分子功能奠定基础。试的植物材料是北美桂花品种“ B80”（传染性材料），这是在实验室中多年获得的高世代杂交系。疫疫霉菌株是HNG5，是从广东省广州市白云实验基地的桂花病菌株中分离纯化得到的。物培养和接种处理植物材料的种植：将测试材料'B80'放在育苗缸中，种植10杯，每杯5到6粒种子，并放置在具有人工气候（RTOP）的室内-1000Y）。
养条件如下：28℃10h，光照24h，交替24℃14h，湿度85％。使用10毫米桂花的幼苗进行接种。霉菌的培养和孢子形成：切碎一小部分疫霉菌HNG5，分离并储存在固体V8培养基中（200毫升V8水果和蔬菜汁，3.0克碳酸钙，20克琼脂，800毫升无菌水，调节pH值）。育至6.3）并在黑暗环境中于25°C孵育4天，然后将板切成0.5 cm2的小块，并放入无菌小瓶或组织培养瓶中（10小件/瓶）。V8液体介质在液面略低于板的高度，并每隔12小时更换一次消毒水，每3天更换一次水以诱导孢子：将培养瓶放在4°C的冰箱中放置15分钟，然后在室温下放置30分钟。少，即产生大量的孢子。
血球计数器计数游动孢子的数目，并调整到游动孢子浓度为5 x 10 3 / ml，以便对桂花幼苗进行生根接种。种处理：接种前12小时灌溉要接种的幼苗，将50 ml孢子悬浮液放入量筒中，小心地倒入苗圃杯中，并用蒸馏水作对照，治疗后分别在0、24、48和72小时。幼苗的根和茎固定在液氮中，并保存在-80°C的冰箱中，以备后用。5mmol / L的SA和100μmol/ L的乙醇溶液，在心脏的第二叶期和幼苗期以同样的方式对'B80'试验植物进行SA和MeJA处理。MeJA（全部溶于10％乙醇溶液中），喷洒幼苗叶片，以10％乙醇溶液为对照。植物根上方的根固定在液氮在喷涂后0、12和24小时内保存在-80°C的冰箱中以备后用。RNA的提取和逆转录是在-80°C的冰箱中存储的单个样品上进行的，然后用RNAiso Plus（Takara）提取总RNA，然后对MRNA样品进行处理用DNaseI（37°C，30分钟）电泳，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。过NanoDrop 2000测量和测定浓度，发现mRNA对于逆转录反应是可接受的。据RT-qPCR特异性逆转录试剂盒（带有gDNA橡皮擦的PrimeScript™RT试剂盒，Takara）合成第一条cDNA链，并稀释10倍用作RT-qPCR反应模板。RT-qPCR基因表达的引物设计和分析根据Ling等[21]提供的桂花WRKY基因的注释编号，在cDNA中寻找该基因序列。花基因组（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）。据RT-qPCR引物的设计要求，使用Primer Premier 6.0引物设计软件设计引物，并将其提交给Shanghai Biotech，后者将其用于后续的RT-qPCR反应。过参考荧光定量试剂盒（Prempix SYBRR Ex Taq™II，Takara）进行略微修改，进行RT-qPCR操作。
SA处理（MeJA）下基因表达上调（下调）的方法与之前相同：被认为是在处理后12和24小时之内。此，当Ft≥1的基因受到外源激素的影响时。导（抑制）。这项研究中，通过引物设计并合成了55个桂花基因组基因，每对引物均经过测试，以确定其特异性，扩增效率以及RT-qPCR反应后引物二聚体的存在。CsWRKY55以外的几种设计和筛选。选了其他54个CsWRKY中合适的RT-qPCR引物（表1）。这项研究中，桂花基因组中的54个CsWRKY基因在疫霉菌处理后的0、24、48和72小时表达。明疫霉处理后0、24、48和72小时样品中CsUBQ参考基因的ct值分别为19.37至21.42、19.97至22.55、18。71至21.39和18.40至22.70。这种情况下，必须检测到CsWRKY。> 33.0，则认为CsRKYs基因表达极低，数据不可靠且不参与后续分析。CsWRKY基因表达分析的结果表明，在包括8个CsWRKY基因（CsWRKY9，20）的受试样品中，CsWRKY基因的表达水平通常较低，低于CsUBQ参考基因。28，30，35，36，38）。39）表达水平极低，单个样品中检测到的峰> 33.0，并且不进行进一步分析。余46个CsWRKY基因的数据分析结果如图1所示。15个CsWRKY基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44， 46、48、52和56）。是由疫霉疫霉诱导的，并表现出两次以上的正调控表达。导最多的基因是CsWRKY44，其正调控表达高达361倍。外，疫霉菌强烈诱导CsWRKY13、26、41和56，并且正调控的基因表达增加了10倍以上。15种诱导表达基因中，有11个基因（CsWRKY11、13、22、26 （34、41、44、46、48、52和56）在接种后72小时达到最高表达水平；接种后48小时有3个基因（CsWRKY21、23和31）达到最高表达，接种后24小时只有一个基因（CsWRKY3）达到最高表达。这46个基因中，只有疫霉疫霉菌被CsWRKY6抑制，而接种72 h后，负调控基因的表达是3.2倍。种疫霉菌后，检测到的46个CsWRKY基因中有16个被马铃薯疫霉菌诱导，并且一个CsWRKY基因被抑制，这意味着这16个CsWRKY基因可能与桂花有关。疾病的抵抗力。了检测与疾病有关的信号通路，通过外源激素SA分析了这16个基因的表达。果显示在图2-A中：除CsWRKY6外的15个基因被下调并且包括15个基因。达水平均被不同程度地调节，并且12个基因（CsWRKY3、11、13，桂花树价格CsWRKY21、22、23、26、31、34、41、44和46）达到最高水平。
SA治疗后数小时。下降趋势，AS治疗后其他三个基因（CsWRKY48、52和56）逐渐上调，并在24小时内达到最高水平。15个上调基因中的八个具有CsWRKY的正调控表达（CsWRKY26、34、41、44、46、48、52和56），而CsWRKY44的正调控表达最高，超过9倍。基因被认为最可能与对桂花病的抗性有关，桂花树价格并参与与AS介导的疾病有关的信号传导途径。
这项研究中，致病疫霉和致病疫霉诱导了15个CsWRKY基因，其中在拟南芥中发现了7个（CsWRKY21、26、31、34、41、46和48）。同源基因[21]。以前的研究中，CsWRKY34同源基因AtWRKY70是RPP4介导的对霜霉病的抗性和基本抗性的重要成员，并在晚疫病的缺陷途径中调节活性氧。体中SA的产生和积累[23]。病疫霉诱导了CsWRKY46的AtWRKY8同源基因，SA途径下调了对丁香假单胞菌的基础抗性，JA途径上调了对灰葡萄孢的抗性[24]。项研究假设，响应生物应激反应，桂花和拟南芥中的同源WRKY转录因子基因也可能在功能上相关。WRKY是病原体和SA诱导的转录因子最重要的基因，并且在调节水杨酸依赖性基因的表达中起重要作用。Dong等[14]分析了72个拟南芥WRKY转录因子基因的表达模式，发现其中的49个是由病原体或含有无毒基因的SA基因诱导的。这项研究中，检测到的54个C. sinensis CsWRKY基因中有15个被疫霉菌上调，而其中的8个被AS同时诱导。果与以前的研究一致。SA和JA是引起植物抗病性的两个常见信号分子，以前的研究表明，SA和AL携带的植物抗病性途径并不相互独立。们普遍认为它们具有拮抗作用[25]。拟南芥中，AtWRKY62基因由AS诱导，并在抑制对AJ的反应中起作用。
Atwrky62突变体中JA反应基因的表达增加，而在AtWRKY62过表达时JA反应基因的表达减少[26]。水稻中，OsWRKY13的过表达可能会增加水稻对米生黄单胞菌和米格纳霉的抗性，这受生物合成基因的激活和对AS的反应的调节，同时抑制JA信号传导途径[ 27-28]。外，还报道了两者之间的协同作用。水稻中，SA和JA诱导后OsWRKY30和OsWRKY83上调[15，29]。这项研究中，CsWRKY44同时被SA和MeJA上调，表明CsWRKY44可能在两个泳道节点都参与SA和JA介导的防御反应信号通路。而，防御反应的调节是一个复杂的过程，尚需确定CsWRKY44是否真正调节由SA和JA介导的信号通路的协同作用。
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SA和MeJA的作用下，SA诱导了CsWRKY的7个基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56），SA和MeJA共同诱导了CsWRKY44的基因，而CsWRKY6由MeJA下调，抑制，假设有7个基因（7）。CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）可以通过AS介导的信号通路调节植物对病原体的反应; CsWRKY6可以通过Y介导的信号通路调节植物防御反应。CsWRKY44可能同时参与AS和与疾病抗性相关的AJ介导的信号通路。花是重要的蔬菜作物。南地区受到极端温度和高湿度的影响。花鼠疫的病害很严重，但是由于缺乏高抗性的材料，因此对燃烧的抵抗力很慢，并且研究了对桂花的抵抗力的遗产。达森等[1]也认为，以生物技术为主要手段的抗性转移研究的发展对当前对甜瓜病抗性的选择至关重要。录因子WRKY来源于早期的真核生物，广泛分布于高等植物中。是植物中最大的转录因子家族之一[2]，并以约60个氨基酸的保守WRKY域命名。守的WRKYGQK的七个氨基酸残基在氨基-N（末端）末端附近构成该结构域的中心序列[3]。WRKY转录因子家族是一个很大的基因家族。前，已在稻米[4]，拟南芥74 [5]，玉米136 [6]，大豆133 [7]和大白菜145 [8]中鉴定出至少109个WRKY成员。薯中存在最古老的WRKY SPF1转录因子，其生物学功能是调节糖信号通路的建立[9]。后的研究表明，WRKY转录因子在植物对生物和非生物胁迫的防御反应以及植物花粉发育[10]，种子成熟和发芽[11]中起着至关重要的作用。
]，植物叶片的衰老[12]。生理过程。植物对生物胁迫的响应中，转录因子基因WRKY主要参与各种抗性反应，从基于植物的免疫力到抗性，并通过调节来影响植物病原体多种途径和多种水平的信号转导途径来抵抗疾病。理反应在植物与病毒，细菌，真菌，线虫和昆虫的相互作用中起着重要作用[13]。Dong等[14]分析了72个拟南芥WRKY基因的表达模式，发现其中的49个是由含有SA或SA的病原体诱导的。水稻上，稻瘟病菌诱导后的45个WRKY基因中有15个上调，而12个稻瘟病单胞菌同时诱导，其信号转导表明OsWRKY45和OsWRKY62受到AS的影响。达诱导被上调，JAs上调了OsWRKY10，OsWRKY82和OsWRKY85，SA和JA表达同时上调了OsWRKY30和OsWRKY83 [15]。了拟南芥和水稻等模型植物之外，随后的研究表明，诸如棉花[16]，油菜籽[17]和大麦[18]等作物，以及诸如胡椒的蔬菜作物[19-20]和大白菜[8]。显示WRKY转录因子对病原体诱导的反应有反应。花基因组测序完成后，Ling等[21]在寻找桂花基因组并分析55种冷胁迫下的表达后，发现了55个CsWRKY转录因子基因。干旱和高盐浓度。前，国内外尚无有关桂花抗病反应的WRKY转录因子的报道。研究使用RT-qPCR技术分析并筛选了桂花中CsWRKY基因的表达。析与疾病相关的可能信号传导途径，并为研究CsWRKY在具有愉悦气味的桂花疾病防御反应中的分子功能奠定基础。试的植物材料是北美桂花品种“ B80”（传染性材料），这是在实验室中多年获得的高世代杂交系。疫疫霉菌株是HNG5，是从广东省广州市白云实验基地的桂花病菌株中分离纯化得到的。物培养和接种处理植物材料的种植：将测试材料'B80'放在育苗缸中，种植10杯，每杯5到6粒种子，并放置在具有人工气候（RTOP）的室内-1000Y）。
养条件如下：28℃10h，光照24h，交替24℃14h，湿度85％。使用10毫米桂花的幼苗进行接种。霉菌的培养和孢子形成：切碎一小部分疫霉菌HNG5，分离并储存在固体V8培养基中（200毫升V8水果和蔬菜汁，3.0克碳酸钙，20克琼脂，800毫升无菌水，调节pH值）。育至6.3）并在黑暗环境中于25°C孵育4天，然后将板切成0.5 cm2的小块，并放入无菌小瓶或组织培养瓶中（10小件/瓶）。V8液体介质在液面略低于板的高度，并每隔12小时更换一次消毒水，每3天更换一次水以诱导孢子：将培养瓶放在4°C的冰箱中放置15分钟，然后在室温下放置30分钟。少，即产生大量的孢子。
血球计数器计数游动孢子的数目，并调整到游动孢子浓度为5 x 10 3 / ml，以便对桂花幼苗进行生根接种。种处理：接种前12小时灌溉要接种的幼苗，将50 ml孢子悬浮液放入量筒中，小心地倒入苗圃杯中，并用蒸馏水作对照，治疗后分别在0、24、48和72小时。幼苗的根和茎固定在液氮中，并保存在-80°C的冰箱中，以备后用。5mmol / L的SA和100μmol/ L的乙醇溶液，在心脏的第二叶期和幼苗期以同样的方式对'B80'试验植物进行SA和MeJA处理。MeJA（全部溶于10％乙醇溶液中），喷洒幼苗叶片，以10％乙醇溶液为对照。植物根上方的根固定在液氮在喷涂后0、12和24小时内保存在-80°C的冰箱中以备后用。RNA的提取和逆转录是在-80°C的冰箱中存储的单个样品上进行的，然后用RNAiso Plus（Takara）提取总RNA，然后对MRNA样品进行处理用DNaseI（37°C，30分钟）电泳，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。过NanoDrop 2000测量和测定浓度，发现mRNA对于逆转录反应是可接受的。据RT-qPCR特异性逆转录试剂盒（带有gDNA橡皮擦的PrimeScript™RT试剂盒，Takara）合成第一条cDNA链，并稀释10倍用作RT-qPCR反应模板。RT-qPCR基因表达的引物设计和分析根据Ling等[21]提供的桂花WRKY基因的注释编号，在cDNA中寻找该基因序列。花基因组（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）。据RT-qPCR引物的设计要求，使用Primer Premier 6.0引物设计软件设计引物，并将其提交给Shanghai Biotech，后者将其用于后续的RT-qPCR反应。过参考荧光定量试剂盒（Prempix SYBRR Ex Taq™II，Takara）进行略微修改，进行RT-qPCR操作。
SA处理（MeJA）下基因表达上调（下调）的方法与之前相同：被认为是在处理后12和24小时之内。此，当Ft≥1的基因受到外源激素的影响时。导（抑制）。这项研究中，通过引物设计并合成了55个桂花基因组基因，每对引物均经过测试，以确定其特异性，扩增效率以及RT-qPCR反应后引物二聚体的存在。CsWRKY55以外的几种设计和筛选。选了其他54个CsWRKY中合适的RT-qPCR引物（表1）。这项研究中，桂花基因组中的54个CsWRKY基因在疫霉菌处理后的0、24、48和72小时表达。明疫霉处理后0、24、48和72小时样品中CsUBQ参考基因的ct值分别为19.37至21.42、19.97至22.55、18。71至21.39和18.40至22.70。这种情况下，必须检测到CsWRKY。> 33.0，则认为CsRKYs基因表达极低，数据不可靠且不参与后续分析。CsWRKY基因表达分析的结果表明，在包括8个CsWRKY基因（CsWRKY9，20）的受试样品中，CsWRKY基因的表达水平通常较低，低于CsUBQ参考基因。28，30，35，36，38）。39）表达水平极低，单个样品中检测到的峰> 33.0，并且不进行进一步分析。余46个CsWRKY基因的数据分析结果如图1所示。15个CsWRKY基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44， 46、48、52和56）。是由疫霉疫霉诱导的，并表现出两次以上的正调控表达。导最多的基因是CsWRKY44，其正调控表达高达361倍。外，疫霉菌强烈诱导CsWRKY13、26、41和56，并且正调控的基因表达增加了10倍以上。15种诱导表达基因中，有11个基因（CsWRKY11、13、22、26 （34、41、44、46、48、52和56）在接种后72小时达到最高表达水平；接种后48小时有3个基因（CsWRKY21、23和31）达到最高表达，接种后24小时只有一个基因（CsWRKY3）达到最高表达。这46个基因中，只有疫霉疫霉菌被CsWRKY6抑制，而接种72 h后，负调控基因的表达是3.2倍。种疫霉菌后，检测到的46个CsWRKY基因中有16个被马铃薯疫霉菌诱导，并且一个CsWRKY基因被抑制，这意味着这16个CsWRKY基因可能与桂花有关。疾病的抵抗力。了检测与疾病有关的信号通路，通过外源激素SA分析了这16个基因的表达。果显示在图2-A中：除CsWRKY6外的15个基因被下调并且包括15个基因。达水平均被不同程度地调节，并且12个基因（CsWRKY3、11、13，桂花树价格CsWRKY21、22、23、26、31、34、41、44和46）达到最高水平。
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Atwrky62突变体中JA反应基因的表达增加，而在AtWRKY62过表达时JA反应基因的表达减少[26]。水稻中，OsWRKY13的过表达可能会增加水稻对米生黄单胞菌和米格纳霉的抗性，这受生物合成基因的激活和对AS的反应的调节，同时抑制JA信号传导途径[ 27-28]。外，还报道了两者之间的协同作用。水稻中，SA和JA诱导后OsWRKY30和OsWRKY83上调[15，29]。这项研究中，CsWRKY44同时被SA和MeJA上调，表明CsWRKY44可能在两个泳道节点都参与SA和JA介导的防御反应信号通路。而，防御反应的调节是一个复杂的过程，尚需确定CsWRKY44是否真正调节由SA和JA介导的信号通路的协同作用。
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