[桂花树价格]桂花绿色害虫花叶病毒纳米粒子荧光试剂条的制备
时间：2019/11/29 6:32:37 浏览量：
以桂花绿斑驳花叶病毒和稀土荧光纳米粒子为标记，制备了稀土荧光纳米粒子测试条，建立了有效而敏感的测试方法。种荧光免疫技术系统，用于精确检测桂花绿斑驳花叶病毒，以开发一种检测方法，可用于快速方便地检测桂花绿斑驳花叶病毒（CGMMV）。花绿滑板花叶病毒（CGMMV）是葫芦类作物上的一种重要害虫控制病毒，主要存在于欧洲，印度和日本，对西瓜，甜瓜构成重大威胁桂花等。产通常会使产量减少约15％[1]。宁省盖州市已感染了桂花绿腐病花叶病毒，造成重大损失。产，因此加强病毒的检测极为重要。速检测技术是有效预防桂花绿m花叶病毒传播的重要保证，现有的病毒检测方法主要是酶联免疫吸附试验（ELISA）。
试环境，人员和设备质量要求高，血清价格昂贵，无法满足快速现场测试的需要。外，还开发了各种快速诊断方法，例如聚合酶链反应RT-PCR [2]，免疫捕获RT-PCR（IC-PT-PCR）[3]，实时荧光RT-PCR [4]等但是，这些分子生物学中的检测方法具有操作昂贵，操作繁琐的缺点，不能满足一线测试人员或现场测试的需要。此，在本研究中，以桂花绿斑驳的花叶病毒为检测对象，并以桂花绿斑驳的花叶病毒特异性抗体制备了鸡血藤的免疫层析试纸。用荧光稀土纳米粒子作为标记的大理石马赛克绿色稀土。
立快速，灵敏，准确的荧光免疫分析系统，检测桂花绿色花叶病毒。血清白蛋白（BSA）购自Biotech Bioengineering（Shanghai）Co.，桂花树价格Ltd.，山羊抗小鼠IgG购自China Crystal Biotechnology Co.，Ltd.，以及硝酸纤维素膜。维素玻璃膜则购自美国密理博。
浮颗粒；分别添加100 mg / mL的硫代-NHS和EDC 200μL，在室温下摇动30分钟，离心，弃去上清液，并用1 mL 50 mmol / L MES（pH 6.0）洗涤一次;使用1 mL 50重悬浮颗粒的mmol / L MES（pH 6.0），向桂花绿色花叶病毒花叶病毒中加入适量的纯化单克隆抗体，在室温下振摇1分钟。时，加入等体积的PBS-BSA（BSA含量2％，pH 7.4）。），继续反应1小时；离心，弃去上清液，用50 mmol / L MES（pH 6.0），1 mL /小时洗涤颗粒3次；使用300μL重悬液[10 mmol / L Tris-HCl（pH 8.0），10％蔗糖]重悬颗粒，在4°C下储存并保留。照上述方法，将50、100、150、150、200、250和300μg单克隆抗体溶液去除，并偶联至荧光纳米颗粒，并用试剂盒检测缀合的上清液中存在的抗体。BCA蛋白检测测试并选择最佳抗体浓度使用斑点测量设备组装测试条，以将单克隆抗体-荧光纳米颗粒偶联物喷洒到结合缓冲液和1.5 mg上。升的桂花绿色斑驳花叶病毒和1毫克/毫升的硝酸纤维素膜上1毫克/毫升的山羊抗小鼠IgG用作检测和质量控制品系。将硝酸纤维素膜，结合缓冲液，样品缓冲液和吸收缓冲液胶合到PVC衬垫上。合缓冲液和吸收垫与硝酸纤维素膜部分重叠，并与硝酸纤维素膜重叠约2 mm；样品垫部分覆盖键合板，两者重叠约4 mm；粘贴后将测试条切成4毫米宽，放入密封袋中，添加干燥剂，密封并在4处保存。
测方法：将1克叶子放入干净的塑料袋中，添加3 ml PBST（1 x PBS，桂花树价格0.5％Tween20，pH 7.4），在塑料袋中擦拭叶子，然后取测试汁。200μL提取物添加到反应杯中，插入试纸，继续反应5分钟，然后在紫外光下用肉眼观察结果。纸已针对西葫芦花叶病毒（ZYMV），宜人的桂花花叶病毒（CMV），烟草花叶病毒（TMV），番木瓜圆斑（PRSV），南瓜花叶病毒（SqMV）和烟草环斑病毒（TRSV），瓜类坏死斑病毒（MNSV）和花叶病毒桂花绿腐病（CGMMV）用作特异性检测的参考。试方法与上述相同。定性测试将测试条在37°C下放置7天，每天测试阳性样品的稳定性。体金试纸的灵敏度比较测试使用40 nm的胶体金胶体金，参照Frens方法[6]制备胶体金试纸。
相同的阳性样品用PBST稀释8、16、32、64、128倍，并用胶体金和荧光颗粒测试条进行测试。鼠腹水抗体滴度的间接酶法测定为1：1：1，000，000。释单克隆抗体后，分别加入50、100、150、200、250和300μg抗体溶液将单克隆抗体与50μL1 mg / mL纳米颗粒偶联，然后通过BCA蛋白检测试剂盒检测上清液。体的最佳剂量是抗体的浓度，即刚好高于上清液中抗体浓度的第一浓度。测试确定150μg和50μl的颗粒更优选共价偶联。过优化测试线和质量控制线的涂覆条件，最终确定了最佳的免疫色谱系统：随着第二抗体涂层浓度的增加，测试线的亮度也逐渐增加。到1.5 mg / mL后。度不再显着增加，因此检测线的最佳包被条件是1.5 mg / ml的二抗。1显示了优化的检测曲线：随着第二抗体包被浓度的增加，质量控制链的亮度也逐渐增加，达到2级后亮度不再显着增加，5 mg / mL，以便确定质量控制链的最佳包装。抗调节至2.5 mg / mL。2显示了优化的质量控制线。
米荧光试纸用于检测9种植物病毒的阳性样品，如桂花绿斑驳的花叶病毒和西葫芦花叶病毒，没有反应。桂花以外，还有绿色大理石纹花叶病毒。型的测试结果如图3所示。
测试条在37°C下放置7天，并测试不同浓度的阳性样品的稳定性。试结果证实，在37°C下放置7天后，条带灵敏度没有明显降低，表明它是稳定的。体金试纸的制备随着单克隆抗体-胶体金结合物数量的增加，当包括添加量时检测线和质量控制线的信号变得越来越强大在0至6μL之间，信号强度显着提高。于6μL的信号强度仍会增加，但不再明显。虑到非特异性反应和其他因素，胶体金的量设置为6μL。体金试纸的典型反应结果如图4所示。过用PBST比稀释相同的阳性样品来比较灵敏度，并分别通过胶体金和免疫色谱法进行检测。中，用裸眼解释荧光测试条，并且解释结果示于表1中。表1所示，荧光纳米颗粒测试条的灵敏度大于荧光纳米颗粒的灵敏度。体金试纸。大不同类型的测试条后的灵敏度结果为4x 4xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx +--荧光纳米颗粒测试++++-纸条（眼睛）注意：+表示阳性，-表示阴性。为这项研究的一部分开发的荧光纳米粒子免疫色谱测试条可以在10分钟内获得检测结果，这比传统的检测方法（如PCR（1-2小时）和测试）要快得多。ELISA（1-2小时），可提高检测效率：此方法适用于单样品检测和大批量样品的快速检测；它不需要很高的控制能力，操作员只需简单的培训就可以自主执行检测工作。要精确，大规模的测试仪器，并且只需要一个紫外灯，这很容易实现。近年来发展迅速的胶体金测试条相比，荧光纳米颗粒包含许多荧光颗粒，它们具有良好的光性能，并且荧光信号比传统的标记物质强大得多。花绿色宏观花叶病毒检测荧光纳米颗粒的试纸已成功开发。是一种快速检测桂花绿色宏观花叶病毒（一种植物保护工具）的出色检测方法。
利的工具还为其他快速检测方法（如微生物和病毒）奠定了坚实的基础。
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测方法：将1克叶子放入干净的塑料袋中，添加3 ml PBST（1 x PBS，桂花树价格0.5％Tween20，pH 7.4），在塑料袋中擦拭叶子，然后取测试汁。200μL提取物添加到反应杯中，插入试纸，继续反应5分钟，然后在紫外光下用肉眼观察结果。纸已针对西葫芦花叶病毒（ZYMV），宜人的桂花花叶病毒（CMV），烟草花叶病毒（TMV），番木瓜圆斑（PRSV），南瓜花叶病毒（SqMV）和烟草环斑病毒（TRSV），瓜类坏死斑病毒（MNSV）和花叶病毒桂花绿腐病（CGMMV）用作特异性检测的参考。试方法与上述相同。定性测试将测试条在37°C下放置7天，每天测试阳性样品的稳定性。体金试纸的灵敏度比较测试使用40 nm的胶体金胶体金，参照Frens方法[6]制备胶体金试纸。
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