[桂花树价格]魔芋中桂花花叶病毒的分子检测方法

　　为了建立有效检测魔芋中桂花花叶病毒的方法，采用实时ELISA，RT-PCR和PCR检测方法检测花叶病毒。芋中的桂花（CMV）。果表明，桂花花叶病毒在魔芋叶片中的不稳定程度较小，并且酶联酶检测和RT-PCR都不能有效检测花叶病毒。花。
　　有实时PCR可以检测到它。结果为魔芋中桂花花叶病毒的快速，准确分子鉴定提供了技术支持。芋（魔芋魔芋）是魔芋属多年生草本植物，含有大量的葡甘露聚糖，已有2000多年的历史[1]。年来，随着葡甘露聚糖产品的发展，食品，化学和保健品市场对魔芋产品的需求逐年增加。而，由于多年生魔芋的无性繁殖，不能保证病毒的积累，物种的降解，高产和高质量，这一问题严重限制了魔芋人工林的发展。个部门[2]。瓜花叶病毒（CMV）是Bromoviridae家族的Cucumovirus属的典型成员，该病毒在全球范围内分布。
　　具有广泛的寄主范围，可以感染52个科的174属775株植物[3]。感染了桂花花叶病毒的叶子上，特别是嫩叶上，会出现黄绿色花或叶绿体梭形斑点形式的条纹，并且叶子的边缘略微卷曲[4]。究表明，CMV包膜蛋白（CP）与病毒颗粒组装和蚜虫传播有关[5，6]。目前为止，还没有针对CMV开发出一套安全，有效和稳定的病毒预防和控制技术。此有必要对其进行研究。前，用于检测CMV的方法主要是ELISA，桂花树价格电子显微镜和PCR [7-9]。时荧光定量PCR是指将荧光团添加到PCR反应系统中的方法，它利用荧光信号积累来实时监控整个PCR过程并最终进行定量使用标准曲线的未知模型。常规PCR相比，它具有以下优势：高特异性，高灵敏度，良好的重现性，精确的定量，高度自动化和完全受控的响应，成为分子生物学研究的重要工具。时定量PCR具有广泛的应用，包括mRNA表达的研究，DNA拷贝数的检测和单核苷酸多态性的确定[10]。
　　前，关于魔芋疾病，特别是魔芋桂花叶病毒的研究很少，这种病毒仍然是处女。此，在结合以往植物病毒检测特性的研究基础上，本研究建立了一种实时PCR检测桂花花叶病毒的方法，并将其与魔芋病毒的ELISA和RT-PCR。速诊断提供了技术基础。花花叶病毒是从带有桂花花叶病毒的辣椒叶中提取的。种物是无魔芋魔芋cv病毒的植物。江，获自组织培养。剂：植物总RNA提取试剂盒（天健生化科技有限公司），5×M-MuLV逆转录酶缓冲液，M-MuLV逆转录酶（Promeg Biotechnology Co.，Ltd。dNTP ，10×Taq反应缓冲液，Taq DNA聚合酶，DL 2000标记（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），6×上样缓冲液（宝生物工程有限公司），CMV ELISA试剂盒（北京Boosid生物技术） Co.，Ltd。THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 2.0（Toyobo Biotechnology Co.，Ltd.）。物由英军生物有限公司合成。上海舜宇生物技术有限公司确定。器：SIGMA 2-16K高速离心机，Elx800酶标仪，ABI第一步荧光定量PCR仪。毒的接种将含有病毒（约0.5 g）的新鲜辣椒叶切成薄片，并在接种缓冲液（5 ml PBST，0.1 g PVP-40、0.005 g BSA， 0.022克铜试剂）。一小块纱布过滤到1.5毫升的EP管中，并插入冰水中以备后用。一根干净的钢丝球，取下生病的汁液并将其擦在健康的魔芋叶子上，接种后，用去离子水冲洗叶子表面以消除棉塞对皮肤的影响。片代谢。天后，观察到斑点魔芋植物。1）和叶片卷曲（图2）是桂花叶病毒感染的两个典型症状，表明桂花叶病毒已经成功感染了健康的魔芋植物。过人工接种。DAS-ELISA检测用桂花花叶病毒称取0.3 g魔芋叶，加入3 mL PBS（pH 7.4），用手或匀浆研磨样品，离心20分钟并收集上清液。个必须在包装后进行测试，另一个必须冷冻以备后用。考ELISA试剂盒方法，在反应停止后15分钟内，使用酶标仪读取并测量405 nm的OD值。据判断标准：阳性对照平均值≥1.00，阴性对照平均值≤0.10，临界值=阴性对照孔+ 0.15，样品的OD值<临界值为负且值为样品的OD≥临界值为正。RT-PCR检测使用总植物RNA提取试剂盒从魔芋叶中提取总RNA，并作为阳性对照，从桂花花叶病毒辣椒叶中提取总RNA。体方法根据说明进行。

　　GTTTCGCG-3'，5'-CGGCGTACTTCTCATGTCAC-3'，扩增的靶序列片段的长度为230bp。系统：总反应系统25μL，加入总感染的魔芋RNA 1μg，Oligo dT 15 2μL（0.5μg/μL），于72变性5分钟，立即移出并置于冰上5分钟然后加入5×M-MuLV 5μL逆转录酶缓冲液，2μLdNTP（10 mmol / L），1μL（50 U /μL）M-MuLV逆转录酶，然后加入经DEPC处理的ddH2O5。升。反应混合物在PCR仪器中在42℃下保存90分钟，并在70℃下保存10分钟，并在-20℃的温度下保存直至使用。

　　PCR系统（25μL）：1.5μLcDNA，1μL（10μmol/ L）每种引物，0.5μLdNTP（10 mmol / L），2.5μL10×缓冲液， 2μL（25 mmol / L）的MgCl 2，Taq酶。1 U /μL，ddH2O 15.5μL。PCR反应步骤：采用标准PCR，在94℃预变性5min，在94℃变性30s，在56℃退火30s，在72℃延伸5min，36个循环，最后在72℃ 5分钟取4μLPCR产物，约1μL溴酚蓝，使用DL 2，000作为标记物和琼脂糖凝胶电泳（1.0％凝胶浓度，TBE缓冲液系统）。EB染色后，在标准UV中使用凝胶成像系统。灯光下成像。时PCR检测用于实时PCR的引物与用于RT-PCR的引物相同。应体系为20μL：2μL反向模板cDNA，2.0×SYBR Master Mix 10μL（已添加Rox），上下游0.5μL（20μmol/ L）引物和去离子水组成20μL。PCR反应的时间表是在95°C下进行40循环15秒，在60°C下进行1分钟。带有桂花花叶病毒的辣椒叶用作阳性对照，每个样品安装三份重复样品，并在ABI Step One实时PCR仪上进行反应。PCR产品已发送至上海舜宇生物技术有限公司。于DNA测序，并提供了DF产品和引物用于单向测序。Clustal X 1.83软件分析DNA序列，并在NCBI上进行BLAST序列的比对。CMV ELISA试剂盒检测了带有桂花叶病毒的魔芋叶，检测结果为阴性，表明桂花叶病毒对叶的ELISA敏感性魔芋很虚弱。花花叶病毒接种的魔芋叶在RT-PCR下未扩增目标条带，而阳性对照扩增了目标条带约230 bp（图3）。芋叶有典型的桂花感染。叶病毒的症状，但其病毒载量远低于胡椒的载量，很难通过普通PCR检测到。花叶病毒在魔芋叶片中的实时PCR结果如图4所示。图4中可以看出，在阳性对照和在阴性对照中均检测到荧光信号。CT = 30的样品的荧光信号在大约36个循环中达到了平稳期，从融解曲线可以看出，该条带的特异性很强，可以通过以下方法确定基本方式。是靶序列扩增的结果。增的条带序列和相应的桂花花叶病毒序列的覆盖率可以达到100％，相似性可以达到99％，表明所得的DNA片段是CMV基因的片段。

　　
　　果表明，实时荧光定量PCR可以准确检测魔芋植物中的CMV。先前的实验中，魔芋中的桂花花叶病毒研究很少，并且检测困难，其中选择了ELISA，RT-PCR和实时PCR三种方法检测并比较魔芋叶片中的桂花花叶病毒。果表明，ELISA法和RT-PCR法不能有效地检测魔芋中的桂花花叶病毒，因为魔芋叶上的桂花花叶病毒具有较低的毒性和理化特性。子中的多糖与RNA相似。时，多糖RNA也被去除，导致RNA产量下降，而多糖沉淀，使两者难以分离，导致RNA降解和损失。有多糖的RNA沉淀物难溶于水或溶解的溶液具有很高的粘性，这会抑制许多酶的活性[12]，导致所得RNA的浓度降低，因此很难用普通的检测方法进行检测。时PCR技术是近年来发展最快的技术之一。

　　结合了荧光技术和常规PCR扩增系统，克服了常规PCR技术的弱点并简化了检测过程。的灵敏度很高，可以达到普通PCR反应的100倍[11]。其是，使用SYBR Green I荧光染料进行实时PCR便宜，可以有效地检测魔芋叶片中的桂花花叶病毒，并可用于检测花叶病毒病。芋种植区中的魔芋桂花。外，该方法可以用于病毒载量的绝对定量，桂花树价格并且该技术还可以用于研究植物中CMV的运动，抗病遗传物质资源的筛选，宿主-介体的相互作用。毒等
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