小孢子培养及抗根茎大白菜的分子鉴定

　　以10个抗根茎病的桂花品种为试验材料，研究了影响小孢子萌发的因素，并对DH植物进行了抗根茎的分子检测。
　　果表明，基因型是影响胚胎出现的最重要因素：测试的10个品种中只有3个具有胚胎，其中15CR82的最高胚发生率是每个芽3.36。因型还决定着胚状体的类型和大小，胚的大小对绿色幼苗的生长率有一定影响。常，直径大于2毫米的类胚很容易变成绿芽。特异的分子标记CRaEXON4-3筛选根茎抗性基因CRa的DH群体，得到27株带有抗性基因的植物。花（Brassica campestris ssp。
　　ekinensis）属于芸苔属（Brassica Brassica）桂花（Brassica osmanthus fragrans），是起源于中国的重要蔬菜作物。肿是一种由芸苔疟原虫Woron感染引起的全球性疾病[1-2]。要敏感植物是十字花科蔬菜，如桂花，绿白菜，芥末等。[3]。瘤菌病原体属于原生动物根瘤菌，它感染十字花科植物的根毛，并导致根部的薄壁细胞增殖形成肿瘤[4]，从而影响植物的吸水功能。
　　[5]并延缓了地上部分的生长脱水和枯萎[6]。病于1737年在地中海西部（英国）和南欧（前苏联林格勒）首次发现。于其高传染性和多种传播途径，休眠孢子得以释放通过易感植物的根可以在土壤中生存。年[7]，然后传播到世界各地的十字花科蔬菜种植区。外观开始时，蔬菜地上部分的症状并不明显，而且不容易发现，这导致受影响区域的产量急剧下降。

　　肿病又称“根癌”，已成为全球性问题。年来，控制根肿胀的方法主要包括农业控制，生物控制，化学控制和抗病性选择。环境保护，成本和易于管理的角度来看，选择抗病品种是预防和治疗根肿病的最佳解决方案[8]。Nitsch与花药培养同时创建并开发了分离的小孢子（IMC）培养。1982年，德国的利希特（Lichter）率先成功地在甘蓝型油菜上生长了游离小孢子，发现孢子胚及其再生植株的单产要低得多。药文化[9]，引起了育种者的极大兴趣。那时起，小孢子培养技术在农作物特别是芸苔属的市售农作物中迅速发展。用免费的小孢子培养技术，可以快速纯化包含抗病基因的植物，并从大量抗病双倍单倍体（DH）种群中发现具有优异性状的植物有机体作为下一步的父母。
　　牧工作。这项研究中，以桂花为抗药性的10个商品桂花品种被选为材料，并选择了具有胚性的基因型材料。疾病品种的繁殖奠定了基础。于抗根肿胀的桂花材料是15CR37、15CR38、15CR53、15CR82、15CR104、15CR121、15CR122、15CR128、15CR132和15CR136，全部由西北农林科技大学的十字花科蔬菜研究实验室提供。试材料的制备该材料于2016年10月15日在陕西省油菜杂交中心的田间播种，在自然条件下进行春化处理，并对该田进行常规管理。2017年3月26日至2017年4月22日的开花期开始种植该材料。
　　费的小孢子培养桂花开花的早期，每采摘健壮的花序的未开花芽。午8:00至11:30的日子，花蕾的长度为2.0至3.5毫米。镊子摘花芽，小心地提取花粉，用显微镜选择球形细胞，小孢子在单个细胞核中，细胞具有一定程度的透光性。果细胞为三角形和其他不规则形状，并且细胞的颜色非常浅，则为时过早且花蕾过小；如果细胞是卵圆形的，中间部分是深色的，并且透光性差，则表明花粉成熟并且花蕾太大。先将所选的花蕾用75％乙醇灭菌1分钟，然后用0.1％氯化汞灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗3次。入6至10 ml的B5洗涤介质（含13％蔗糖），用玻璃棒压碎花芽以压碎花芽，释放介质B5中的小孢子，用尼龙网过滤。径为50μm，并将滤液收集在离心管中。1，200 rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，加入培养基B5悬浮花粉，再次离心，重复3次后弃去上清液，加入含100 mg / L的NLN-13液体培养物悬浮液中的秋水仙碱（含13％蔗糖）小孢子。小孢子悬浮液稀释并分成四个60 mm培养皿，每个培养皿的平均体积约为5 ml，用石蜡膜密封，置于32°C的培养箱中，于黑暗中生长。

　　48小时取出未污染的样品，将悬浮液添加到离心管中，以1200 rpm离心5分钟，弃去上清液，添加10 ml NLN-10液体培养基（含10％蔗糖）以悬浮将花粉加到悬浮液中，将其置于90 mm培养皿中，密封后置于25℃的黑暗培养物中。10至15天后，肉眼可见白色细颗粒。显示白色细颗粒的培养皿在黑暗中于室温下在摇床上生长并摇动。15天后计数胚胎的比率和胚胎的类型。胚状体的直径小于1mm时，不计算在内。因型对小孢子胚胎发生的影响培育了十种桂花材料，制作了游离小孢子。黑暗培养10天和搅拌培养15天后，计算了胚的发生率和胚的类型。个品种采摘100个花蕾并将它们分配到4个培养皿中，每个培养皿都有25个花蕾。状体类型对幼苗绿化的影响将所有胚状体均一转移到固体MS培养基（MS + 0.2 mg / L KT + 30 g / L蔗糖+ 8 g / L琼脂）中，并放入暗光潜伏期为12 h至12 h，光照强度为1500 lx，温度为24℃，计算2周后的绿化率。DH种群的分子筛选从少量叶片组织上切下所有获得的小孢子植物，并通过简化的CTAB方法提取DNA。因型对桂花中游离小孢子胚发生率的影响不同基因型对大根小孢子的胚发生能力有显着差异。1显示了10种测试材料中的3种获得了胚状体，成功率为30％。中，15CR82的最高发芽率是每芽3.36，其次是15CR136的发芽率是每芽1.32，15CR53的最低发芽率是每芽0.84。状体的形状和大小也与基因型密切相关。料15CR82的胚状体主要是子叶胚和球形胚，胚的数量大，体积小。径通常为0.5到3.0毫米，小于1毫米的胚胎数量更多。料15CR53和15CR136的胚状体主要是子叶胚和畸形胚，它们的大小相对较大，直径通常为1至8 mm（图1）。表2所示，当胚状体的体积达到一定大小时，它有助于变绿。叶胚比其他类胚体更容易形成幼苗，当子叶胚的宽度小于2mm时，通常很难变绿并且不能形成幼苗。15CR53和15CR136的子叶胚大且易于变绿，其绿色转化率分别为67.3％和69.7％，其中15CR82的小类胚状体数量最多。其中大多数是白化病，棕色和绿色的胚状体。数字低，绿化率极低，仅为19.8％。图2中可以看出，对获得的40株DH植物进行了CRa基因的分子检测，并且该植物表现出多态性。27个菌株的扩增带长为705 bp，桂花树价格包含CRa抗性基因并表现出纯合抗性。9个菌株的扩增条带为413 bp，其中不包含CRa抗性基因，并已感染。果表明，纯合抗病植物与易感植物的比例为3：1。品4、27、28和29的条带大小为500 bp，这与抗病性植物的大小不一致。他材料，并显示出材料之间的多态性。因型是游离小孢子培养中胚发生的最关键因素之一，Bhatia等人已经使用了30种印度西兰花品种进行研究，其中13种已经获得了胚状体[10]。
　　松等。桂花的三个微型品种和一个胚进行了实验，获得了胚状体[11]。该实验中，使用10个抗桂花微孢子培养游离的小孢子，其中3个获得了胚状体。15CR82具有最高的胚发生率（每个芽3.36），而15CR53具有相对较低的胚发生率（每个芽0.84）。能不会出现高架或胚状体。此未知条件无法解决之前，由于开花期有限，这是在实验中获得足够的DH植物以确保有足够的DH植物的简单直接方法每天的花蕾。了基因型对小孢子培养的影响外，如何有效利用形成的胚状体也是一个紧迫的问题。实验表明，胚状体的大小对绿化率具有更大的影响。子叶胚的宽度小于2 mm时，通常很难变绿。定由于高的胚发生率，品种，有限的空间和环境受到限制。长胚体并获得更多营养的空间。者试图转移较大的拟胚体，并用新的NLN-10培养基代替，以在黑暗中继续培养而不摇动。果表明，该方法可以促进胚状体的生长并提高绿化率。归因于胚状体的生命空间和可用养分的增加，同时替代了培养基中胚状体产生的某些有害代谢产物。
　　一品种在不同时间的发芽率也不同，表明外部环境条件也将对胚状体的存在产生一些影响。索有利于发芽的环境条件也是增加发芽品种的有效途径。法。用特定的分子标记对根肿病基因的抗性可以快速检测出桂花材料中所包含的疾病抗性基因。这项研究中，通过检测特定CRa分子标记获得的40种DH植物为纯合抗病植物，其中27种带有CRa抗性基因。
　　敏感植物的比例为3：1。于测试的母本植物的材料是杂合植物。据孟德尔遗传定律中的分离定律，测试结果预测抗性纯合植物与敏感纯合植物之间的比例为1：1，这与本测试的结果有很大差异。于幼苗形成过程中胚状体的大量损失，因此无法判断包含脾抗性基因Cra的花粉是更可能形成胚状体还是包含该基因的胚状体。病性更可能形成幼苗。
　　随后的实验中，可以使用有效的方法，例如扩大测试材料的基因型，提高发芽率和提高幼苗形成率，来从纯合遗传材料中获取更多资源。于根茎的抗性，则将其应用于选择实践。
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