抗氧化剂肽酶水解为玉米醇溶蛋白的研究

　　中国是一个大型的桂花种植国，年产量为2.5×108吨。食品工业中，桂花目前主要用于生产桂花淀粉和桂花油，但桂花蛋白的副产物却被拒绝，导致浪费大量桂花。白质资源。
　　桂花蛋白粉为原料，首先用超声波预处理桂花蛋白（超声波功率500 W，超声时间10分钟），然后使用经过超声波预处理的桂花蛋白为原料。解法用于测定体外水解度和抗氧化活性。指标检验中，采用单因素试验和正交试验对酶解工艺参数进行优化，制备了桂花蛋白抗氧化肽。花蛋白抗氧化肽制备工艺的最佳参数为超声功率为500 W，超声持续时间为10 min，碱性蛋白酶[E] / [S]为10％，胰蛋白酶[E]。] / [S]为6％。解温度为60℃，pH为9.0，酶解时间为2h。中，酶解温度和pH值对桂花抗氧化肽的ABTS捕获活性影响最大。中国，桂花已经栽培了470多年。小麦和稻米外，桂花在谷物作物中排名第三。前，中国的桂花种植面积是美国的第二大种植面积。花含有完整的营养成分，桂花蛋白的制备和应用得到了广泛的良好来源。

　　花蛋白粉桂花是湿桂花淀粉的副产品。蛋白质含量达到50％以上。于其在水中的低溶解度，氨基酸的不平衡和粗糙的味道，其在食品工业中的应用非常有限。果，桂花中的绝大多数花蛋白尚未被充分利用，导致浪费增加。花抗氧化剂肽的开发为桂花蛋白粉的深入治疗提供了机会。着保健食品市场的扩大，桂花新功能肽的开发对改善人类健康和促进食品工业的发展具有重要的经济和社会意义。年来，桂花淀粉加工的副产品已得到学术界的认可，这些副产品已逐渐在全球范围内用于开发其潜在价值。人回收了桂花浆，以制备抗生素，酶制剂，谷氨酸钠和蛋白质饲料粉，制造工业发酵培养基，提取菲，制备酸。

　　酸和肌醇[4-6]，桂花的胚芽变成磷脂。是提取的良好来源，精制胚芽蛋白后用作饼干甜品的蛋白添加剂。花蛋白粉已用于从桂花中提取黄素，产生谷氨酸和产生谷醇溶蛋白。花蛋白的组成和特殊氨基酸序列在其肽链中具有不同的功能区，并具有诸如抗氧化剂的肽功能[3，8-9]。用桂花蛋白的这一特性，已经制备了具有各种生物学功能的活性肽[3，10-11]。而，由于对该主题的研究仍然相对有限，桂花活性肽的研究和开发已成为研究的高位。花蛋白粉，陕西森孚天然制品有限公司提供碱性蛋白酶，北京奥兴生物技术有限公司提供；胰蛋白酶，由国药化学试剂有限公司提供； PBS，由上海力菲生物技术有限公司提供； ABTS，NaOH，HCl和过硫酸钾等分析。海景宏实验设备有限公司产品Bain-marie XMTD-8222；金坛市荣华仪器制造有限公司生产的JJ-1型精密定时摇床； 2C起动器pH计，奥豪斯仪器（上海）有限公司产品; ME203E电子秤，METTLERTOLTDO产品； CR20B2高速冷冻离心机，日立产品； SCIENTZ-ⅡD超声波细胞干扰仪，Shinba产品； SynergyHT酶标仪，BioTek产品；涡旋DG-800;产品DGT-800搅拌机，北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品； MH-2微振荡器，麒麟钟仪表制造有限公司产品。

　　
　　自海门市。桂花蛋白粉通过80目筛，制备8％桂花蛋白粉溶液，搅拌均匀，超声功率为500 W，时间为10分钟，在90°C下变性10分钟，并冷却至合适温度，在1 mol / L NaOH或HCl溶液中根据需要调节pH值，同时加入10％碱性蛋白酶和定量胰蛋白酶，水解酶，在90°C下将酶灭活10分钟，然后以8，000 rpm离心10分钟。PH-stat方法[12]（当蛋白质水解至pH值> 6.5时）。ABTS·齿隙测量方法[13]。蒸馏水制备7 mmol / L的ABTS溶液，并将ABTS溶液和过硫酸钾溶液（最终浓度为2.45 mmol / L）以1的体积比混合1制备ABTS储备溶液，并在室温下避光。置12至16小时后，用0.2 mol / L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）将储备溶液稀释一定倍数（20至30倍）。734 nm或0.7±0.02波长处的吸光度，形成ABTS工作液。用移液器，将180μL的ABTS工作溶液移入96孔板的每个孔中，然后向每个孔中添加20μL的样品溶液。拌10秒钟后，确定反应系统在734 nm波长处的吸光度。在使用ABTS工作液。测试分为三组：白色组：向每个孔中添加200μLPBS溶液；对照组：180μLABTS工作溶液加20μLPBS溶液；测试组：180μL的ABTS工作溶液加20μL的样品溶液（稀释20倍）。每个样品浓度建立六次重复，取平均值。些因素中的三个是定量的：已经研究了其中一个因素对桂花蛋白抗氧化剂肽的制备的影响。
　　交实验设计。据以往的单因素经验，将ABTS清除率和桂花的蛋白水解度用作评估指标。定了四个因素和三个水平的正交试验，以进一步优化桂花蛋白水解的技术条件。蛋白酶[E] / [S]分别为4％，6％，8％，10％和12％。解温度为55℃，pH为9.0，酶解4 h后，使用桂花蛋白抗氧化剂肽的ABTS。·清除率是主要的测量指标，桂花的蛋白水解度是辅助指标。量了两者随[E] / [S]的变化。[E] / [S]与桂花抗氧化肽的水解程度和清除自由基之间的关系如图1所示。图1中可以看出，随着[E]的变化] / [S]，桂花蛋白的水解度从4％到8％变为胰蛋白酶的质量分数，水解度变化很大且呈线性，与速率基本相同水解。例变化；当达到10％时，水解率显着降低。管水解度在达到12％时增加，但趋势趋于平缓。因可能是底物的质量分数和数量有限，这限制了碱性蛋白酶和胰蛋白酶与底物的结合，从而导致水解度无限增加，并且随后变化的趋势并非如此不明显，并趋于柔软。要[E] / [S]逐渐增加，所制备的桂花蛋白的抗氧化活性就逐渐增加。[E] / [S]达到8％时，其抗氧化活性最为重要。[E] / [当S]> 8％时，桂花蛋白ABTS·的抗氧化肽的捕获活性降低。
　　添加少量或适量的胰蛋白酶时，桂花蛋白底物可以完全结合到酶上，并且水解产生的短活性肽逐渐增加，因此粗提物的抗氧化活性增加；但是，如果过量添加蛋白酶，则已经产生的肽过度水解会导致分子量较小的肽或游离氨基酸，从而导致具有捕获能力的肽含量降低较高的自由基和自由基清除能力的降低[14]。蛋白酶[E] / [S]为8％，酶解温度为55℃，酶解时间为4小时，pH值依次变化。要指标是桂花蛋白抗氧化肽的ABTS清除率。花蛋白的水解度是辅助指标，两者都有变化。pH与水解度和从桂花抗氧化剂肽中去除自由基之间的关系如图2所示。2显示，随着pH的升高，桂花蛋白的水解度fragrans增加。pH为11时，水解度达到最大，而当pH再次增加时，水解度逐渐降低。

　　解度与蛋白酶的最佳pH密切相关。测试中，使用了两种酶（碱性蛋白酶和胰蛋白酶）进行水解。试中使用的碱性蛋白酶的最佳pH为9至12，胰蛋白酶为8至10。有在pH值在适当范围内时，蛋白酶才能发挥最大作用。开始的pH值为7到10时，胰蛋白酶是主要的酶，可水解，碱性蛋白酶较弱。pH> 10时，碱性蛋白酶成为主要酶，而胰蛋白酶则取决于环境。碱性，因此活力减弱。能是两者的强项和弱项的结合使桂花的蛋白水解度在pH值为11时达到最大值。pH> 11时，pH环境超过了最佳的pH值。
　　性蛋白酶和胰蛋白酶。范围引起酶分子内部构象的改变，即蛋白酶的部分变性，使得酶和底物不能有效结合，并进一步降低了酶的程度。解。花蛋白水解物的抗氧化活性最初随着pH值的增加而增加。

　　pH值为9.0时，桂花蛋白水解物的抗氧化活性达到最大。pH> 9.0后，ABTS对迅速下降的水解产物的自由基清除活性。氧化剂活性的降低可能由两个原因引起：碱性结构导致酶结构的破坏，碱性蛋白酶产生的抗氧化剂肽的浓度较高，而胰蛋白酶从桂花蛋白中的水解更多。;另一方面，虽然碱性环境在足够的时间内破坏了部分酶的结构，而桂花蛋白仍被完全水解，但是强碱性环境破坏了该蛋白的抗氧化肽的理化结构。生的桂花，降低其抗氧化活性，从而降低了水解产物的抗氧化活性。蛋白酶[E] / [S]为8％，pH为9.0，经过4h的酶解时间，主要指标是桂花蛋白抗氧化剂肽的清除率ABTS·，桂花蛋白的水解度是辅助指标。酶解温度的变化。解温度与桂花抗氧化肽的水解程度和清除自由基之间的关系如图3所示。图3可以看出，蛋白质的水解程度桂花随着酶解温度的升高而增加。解温度达到55℃时，水解度最高。后温度继续升高时，水解度大大降低。性蛋白酶和胰蛋白酶的最佳温度分别为55〜70℃和40〜60℃。酶温度低于55度时，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的环境无法达到最佳环境。同的水解时间，桂花蛋白的水解程度不完全；酶解温度超过55℃时，胰蛋白酶结构不再稳定，酶活性降低，桂花的蛋白水解度降低。花蛋白抗氧化剂肽的抗氧化剂活性从一开始就随着酶水解温度的升高而增加。酶促水解温度达到55℃时，水解产物的抗氧化活性最高。酶促水解温度高于55℃时，水解产物的抗氧化活性逐渐降低。酶温度过高时，酶结构发生变化，酶活性降低，这对桂花蛋白抗氧化剂肽的产生产生负面影响。一可能性是，当酶促水解温度太高时，蛋白酶的活性降低。管产生了足够数量的桂花蛋白抗氧化剂肽，但是高温导致桂花蛋白抗氧化剂肽的结构改变并且ABTS的捕获活性降低。蛋白酶[E] / [S]为8％，酶解温度为55℃，pH值为9.0。花蛋白抗氧化肽的自由基清除率是主要指标，桂花蛋白的水解程度是辅助指标。促水解随时间的变化。花抗氧化肽的酶解时间与水解程度和自由基清除率之间的关系如图4所示。图4可以看出，随着时间的增加d水解后，桂花蛋白的水解度逐渐增加。水解时间达到4 h时，水解度达到最大值。间的连续延长不会继续增加水解度，而是在误差范围内。有下降。着酶解时间的延长，桂花蛋白的分子结构发生了很大变化，桂花树价格酶切位点被充分暴露，水解度增加，但是蛋白底物的含量却增加了。花是有限的。4小时后，酶解完成，时间继续延长。解度持续增加，因此保持平坦。着酶解时间的延长，ABTS·的清除率显着增加。解时间为2 h时，ABTS·的清除率最高，持续时间增加，但ABTS·的清除率下降。于反应时间太长而发生这种反应趋势。性蛋白酶和胰蛋白酶会促进桂花蛋白的过度水解，导致破坏低分子量的肽甚至游离氨基酸，从而破坏具有清除自由基能力的多肽，从而影响桂花蛋白。氧化肽的活性[15]。一方面，这可能是由于以下事实：酶促水解时间过长，并且由桂花蛋白水解产生的有效抗氧化剂活性肽过于酶促，从而导致其捕获活性降低。ABTS。据以前的单因素经验，评估的主要指标是ABTS清除率。交实验已被用于进一步优化桂花蛋白水解的技术条件。1列出了正交检验L9（34）的因素和设计水平，表2列出了正交检验结果的分析。2显示了影响主次顺序的因素。
　　案设计中桂花的蛋白水解度为D> C> B = A。围分析表明pH是影响桂花蛋白水解度的关键因素。解最优化程度的完全选择是A2B1C3D3，即[E] / [S]为8％，酶解时间为2 h，酶解温度为温度为60℃，pH值为9.0。据酶解条件的这种组合，可以获得桂花蛋白的最大水解度。据表2至表5的方差分析，发现pH对水解度的影响极为重要，其次是温度的影响。抗氧化剂活性而言，胰蛋白酶作用的主要和次要作用[E] / [S]，酶解温度，pH值和酶解时间对l桂花ABTS蛋白中抗氧化剂肽的含量为C> D> B>A。该范围的分析表明，温度是影响该蛋白抗氧化剂肽ABTS·捕获率的最重要因素桂花在酶促水解过程中，其次是pH值，而[E] / [S]的影响最小。合考虑，制备桂花蛋白抗氧化肽过程的最佳条件为A1B1C3D3，为[E] / [S] 6％，酶解时间为2 h，酶解温度为60 ℃，pH 9.0。
　　以这种方式组合工艺条件时，桂花蛋白的抗氧化剂肽可以达到最高的ABTS清除率。据表4，酶促水解温度和pH值对桂花蛋白抗氧化剂肽的ABTS清除率的影响非常显着，时间的影响相对较小。[E] / [S]的效果可以保存为实验的错误列。3中显示了水解度的方差分析，表4中显示了ABTS·清除率的方差的分析。花和水解产物的抗氧化活性，这可能是由于在测试过程中使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶来控制水解。解度与ABTS·清除率之间没有必然的因果关系。测试主要使用ABTS·桂花蛋白中抗氧化剂肽的清除率作为主要指标。此，将A1B1C3D3的组合用作制备过程的最终条件，以便同时获得良好的水解度和良好的桂花蛋白抗氧化肽。
　　据桂花蛋白酶的水解程度和水解产物的ABTS清除率，优化了被碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解的桂花蛋白的加工条件。固定量的碱性蛋白酶，桂花蛋白水解的最佳条件是60℃，pH 9.0，胰蛋白酶[E] / [S] 6％和2 h。证试验表明，在这种条件下，桂花的蛋白水解率为20.42％，水解产物的ABTS清除率为90.06％±0.7％。在单因素试验和正交试验的试验条件下获得的结果相比，通过正交试验优化的实验条件可以同时获得令人满意的水解度和自由基ABTS的俘获率，并且结果测试更加稳定。
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