安徽省玉米穗腐病的主要致病性镰刀菌的分离鉴定
时间：2020/1/21 6:29:53 浏览量：
为了弄清安徽省桂花耳腐病的主要病原菌镰刀菌的种类，提出了单孢子的分离，形态鉴定和分子生物学鉴定的方法。
花腐烂一直是桂花生产中的重要疾病。花腐烂是由多种病原体引起的。究表明，引起桂花耳腐的主要病原菌是镰刀菌，其次是青霉菌，曲霉菌，木霉菌等，其中小镰刀菌和禾谷镰刀菌复合物F。本科物种是广泛分布的优势致病物种[1]。于地理位置和气候条件的不同，导致桂花腐烂的镰刀菌物种也因地而异。庆地区桂花的主要致病菌是黄萎病菌，禾谷镰刀菌和海带镰刀菌[2]。肃和辽宁省镰刀菌的主要致病物种是黄萎病菌[3-4]。淮海和桂花主要产区的桂花腐烂病的主要病原是黄萎病菌，禾谷镰刀菌和木霉菌[5]。前，尚无关于安徽省桂花主要病原性镰刀菌的系统报道。此，本实验收集了安徽省桂花主要产区的病害标本，并通过生物学形态学和分子学方法分离鉴定了致病性镰刀菌，为防治提供了理论依据。徽省的桂花桂花腐烂病样品采集：2017年，从广东省六个主要桂花桂花生产区采集了226朵桂花耳腐病样品安徽省合肥市，蚌埠市，淮北市，阜阳市，Sheng州市和苏州市。有疾病样本均包装在纸袋中，桂花树价格并送回实验室进行分离和鉴定。
试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；低营养的合成琼脂（SNA的Spezieller nhrstoffarmer琼脂）;水琼脂培养基（WA）。剂：2×Taq Plus预混液，100 bp Plus DNA梯子，5 U Taq DNA聚合酶，10×缓冲液，2.5 mmol / L dNTPs，Pori Biotechnology（Beijing）Co.，Ltd .；镰刀菌属/种属特异性性引物由Biotech Bioengineering（Shanghai）Co.，Ltd.合成。患病的桂花的顶端随机取30粒，放入3％NaClO溶液中，浸泡并灭菌2分钟，然后放入75％乙醇中10 s，快速取出并洗涤在无菌水中，并放入无菌滤纸中吸干水分。机采摘桂花种子，将其放在带有链霉素的PDA平板上，然后在黑暗中于25°C的培养箱中放置。
养后，在4-7天后观察形态。疑似镰刀菌菌株进行单孢分离，并除去部分菌丝体，并将其置于1.0 ml无菌水中，依次稀释以制备最终浓度的孢子悬浮液。1μL和30μL移液到SNA板上。该板均匀地包被并在25℃下培养48小时。出单个菌落并在新的SNA板上培养4至5天以获得纯的单孢子培养菌株[6]。种镰刀菌的分离频率=镰刀菌菌株的相同物种数/镰刀菌菌株总数×100％。纯孢子培养菌株用抗生素接种在PDA和SNA板上，并在4天后测量菌落的直径并计算生长速率。7天后，观察PDA培养基上的菌落形态，颜色变化和SNA。养基上孢子的形态，大小和接种方式的特征。考Booth和Leslie的形态学鉴定方法[7-8]，初步确定了镰刀菌的种类。行PCR扩增以更精确地确定镰刀菌属物种。μLPCR反应系统为：DNA 1.0μL，5U Taq DNA聚合酶0.5μL，10×缓冲液5.0μL，2.5 mmol / L dNTP 4.0μL，引物上游和下游2，分别为0μL和ddH2O补充50.0μL。
PCR扩增程序为：在94°C变性5分钟，在94°C变性40s，在55-59°C退火40s（每种引物的退火温度不同，请参见表1） （有关更多详细信息），延伸至72°C（延伸时间取决于DNA片段的大小）（1000 bp / min），35个循环，并延伸至72℃7分钟。于未通过上述方法鉴定的镰刀菌菌株，将引物TEF-1αF/ R（表1）用于PCR扩增。扩增的产物在1％琼脂糖凝胶上通过电泳检测后送入健康。物技术（上海）有限公司测序。测序结果与NCBI网站上的BLAST进行比较，以确定镰刀菌的种类。
25.0μLPCR反应系统为：DNA 2.0μL，2 x Taq Plus Master Mix 12.5μL，TEF1α-F/ R 1.0μL和ddH2O补充25.0μL。PCR扩增程序是：在95℃下变性5分钟；在94℃变性30s，在55℃退火1min，在72℃延伸42s，35个循环；再在72℃下延伸10分钟。安徽省6个地区的桂花腐烂样品的226个样品中分离到镰刀菌，青霉，腐霉，木霉和曲霉5个属的680个菌株。共分离了455种镰刀菌菌株，并通过科赫法则进行了验证。
680株分离株中，镰刀菌分离率为66.91％，是安徽省桂花腐烂的主要病原菌。霉，腐霉，曲霉和木霉的分离频率较低，分别为15.15％，7.92％，7.12％和2.90％。刀菌的类型最初是通过观察PDA培养基上色素的变化和菌株的生长速率以及SNA培养基上大分生孢子和小分生孢子的形态特征来确定的（图1）。引物Fusarium及其F / R扩增了最初鉴定为镰刀菌的DNA。果表明，455株可以扩增431 bp的目标片段。下来，使用物种特异性引物对上述菌株的DNA进行PCR扩增，并根据片段大小确定镰刀菌的类型（图2）。用引物TEF-1αF/ R通过PCR扩增未扩增靶片段的菌株。因测序和BLAST比对后，最终结果为假黄萎病菌269株，假黄萎病菌97株。革兰氏病。谷镰刀菌（Fusarium graminearum），镰刀菌属（Fusarium spp。62株，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）23株，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）4株。离频率为59.12％，21.32％，13.63％，5.05％和0.88％（表8）。
2）。此，枯萎病镰刀菌是镰刀菌的主要病原体。安徽省桂花中，并广泛分布于安徽省桂花的各种种植区。安徽省六个主要桂花产区分离出455株尖孢镰刀菌，其中合肥80株，蚌埠81株，蚌北74株，淮阳64株，阜阳82株，Sheng州74株。州。萎病菌是6个地区的主要致病性镰刀菌，在合肥，蚌埠市，淮北市，富阳市，Chen州市和苏州市的分离频率为51.25％，45.68％，43.24。％，78.13％，74.39％和64.86％。二种是禾本科镰刀菌，其在合肥，蚌埠，淮北，富阳，Sheng州和苏州的隔离频率分别为17.50％，14.81％，18.92％，21.88％，23， 17％和32.43％。阜阳外，镰刀菌基质已从其他五个地区分离出来，主要分布在合肥，蚌埠和淮北。孢镰刀菌仅从合肥，蚌埠和淮北分离，而镰刀菌黄仅从合肥分离（表2）。上所述，假镰孢和禾谷镰刀菌是镰刀菌的主要病原体。花耳腐病的病原菌很多，其中镰刀菌是耳腐病的主要病原菌。界上大部分地区的桂花。美国，加拿大，阿根廷和巴西的桂花产区，耳腐的主要病原体是镰刀菌[13-15]。中国大部分地区，例如重庆，辽宁，甘肃，山西和陕西，桂花腐烂的主要病原体是镰刀菌[1-4]。究结果表明，在安徽省6个地区采集的桂花样品中，镰刀菌分离率最高，是桂花骨腐烂的主要病原体。安徽省。安徽桂花耳腐病标本中分离鉴定455株枯萎病菌，结果分离到假黄萎病菌的频率为59。是中国桂花最重要的病原体，占12％。与中国大部分地区的鉴定结果是一致的，并且一些研究表明，在中国东北和华北地区，轮叶褐藻的分离频率也更高[1]。中国西北的甘肃省，桂花腐烂的主要病原体是黄萎病菌和黄枯病菌[16]。西南地区的重庆，黄萎病菌，片状镰刀菌和禾谷镰刀菌是镰刀菌的主要病原体[2]。地镰刀菌的隔离频率存在差异，这与气候条件密切相关。些研究表明，干燥温暖的环境有利于镰刀菌假顶点和海带镰刀菌的感染[17-18]。据中国气象网安徽站的数据，2017年安徽省夏季高温持续时间较长，这可能是镰刀菌发生频率较高的原因之一。外，枯萎病黄萎病菌具有多种传播途径，包括通过种子运输，这使其广泛分布在各个地方[19]。花腐烂一直是桂花的重要病害。过对安徽省主要桂花产区的耳腐病标本进行分离鉴定，确定了该病的主要病原菌。徽省的桂花腐烂病是镰刀菌。防和治疗疾病非常重要。
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花腐烂一直是桂花生产中的重要疾病。花腐烂是由多种病原体引起的。究表明，引起桂花耳腐的主要病原菌是镰刀菌，其次是青霉菌，曲霉菌，木霉菌等，其中小镰刀菌和禾谷镰刀菌复合物F。本科物种是广泛分布的优势致病物种[1]。于地理位置和气候条件的不同，导致桂花腐烂的镰刀菌物种也因地而异。庆地区桂花的主要致病菌是黄萎病菌，禾谷镰刀菌和海带镰刀菌[2]。肃和辽宁省镰刀菌的主要致病物种是黄萎病菌[3-4]。淮海和桂花主要产区的桂花腐烂病的主要病原是黄萎病菌，禾谷镰刀菌和木霉菌[5]。前，尚无关于安徽省桂花主要病原性镰刀菌的系统报道。此，本实验收集了安徽省桂花主要产区的病害标本，并通过生物学形态学和分子学方法分离鉴定了致病性镰刀菌，为防治提供了理论依据。徽省的桂花桂花腐烂病样品采集：2017年，从广东省六个主要桂花桂花生产区采集了226朵桂花耳腐病样品安徽省合肥市，蚌埠市，淮北市，阜阳市，Sheng州市和苏州市。有疾病样本均包装在纸袋中，桂花树价格并送回实验室进行分离和鉴定。
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养后，在4-7天后观察形态。疑似镰刀菌菌株进行单孢分离，并除去部分菌丝体，并将其置于1.0 ml无菌水中，依次稀释以制备最终浓度的孢子悬浮液。1μL和30μL移液到SNA板上。该板均匀地包被并在25℃下培养48小时。出单个菌落并在新的SNA板上培养4至5天以获得纯的单孢子培养菌株[6]。种镰刀菌的分离频率=镰刀菌菌株的相同物种数/镰刀菌菌株总数×100％。纯孢子培养菌株用抗生素接种在PDA和SNA板上，并在4天后测量菌落的直径并计算生长速率。7天后，观察PDA培养基上的菌落形态，颜色变化和SNA。养基上孢子的形态，大小和接种方式的特征。考Booth和Leslie的形态学鉴定方法[7-8]，初步确定了镰刀菌的种类。行PCR扩增以更精确地确定镰刀菌属物种。μLPCR反应系统为：DNA 1.0μL，5U Taq DNA聚合酶0.5μL，10×缓冲液5.0μL，2.5 mmol / L dNTP 4.0μL，引物上游和下游2，分别为0μL和ddH2O补充50.0μL。
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25.0μLPCR反应系统为：DNA 2.0μL，2 x Taq Plus Master Mix 12.5μL，TEF1α-F/ R 1.0μL和ddH2O补充25.0μL。PCR扩增程序是：在95℃下变性5分钟；在94℃变性30s，在55℃退火1min，在72℃延伸42s，35个循环；再在72℃下延伸10分钟。安徽省6个地区的桂花腐烂样品的226个样品中分离到镰刀菌，青霉，腐霉，木霉和曲霉5个属的680个菌株。共分离了455种镰刀菌菌株，并通过科赫法则进行了验证。
680株分离株中，镰刀菌分离率为66.91％，是安徽省桂花腐烂的主要病原菌。霉，腐霉，曲霉和木霉的分离频率较低，分别为15.15％，7.92％，7.12％和2.90％。刀菌的类型最初是通过观察PDA培养基上色素的变化和菌株的生长速率以及SNA培养基上大分生孢子和小分生孢子的形态特征来确定的（图1）。引物Fusarium及其F / R扩增了最初鉴定为镰刀菌的DNA。果表明，455株可以扩增431 bp的目标片段。下来，使用物种特异性引物对上述菌株的DNA进行PCR扩增，并根据片段大小确定镰刀菌的类型（图2）。用引物TEF-1αF/ R通过PCR扩增未扩增靶片段的菌株。因测序和BLAST比对后，最终结果为假黄萎病菌269株，假黄萎病菌97株。革兰氏病。谷镰刀菌（Fusarium graminearum），镰刀菌属（Fusarium spp。62株，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）23株，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）4株。离频率为59.12％，21.32％，13.63％，5.05％和0.88％（表8）。
2）。此，枯萎病镰刀菌是镰刀菌的主要病原体。安徽省桂花中，并广泛分布于安徽省桂花的各种种植区。安徽省六个主要桂花产区分离出455株尖孢镰刀菌，其中合肥80株，蚌埠81株，蚌北74株，淮阳64株，阜阳82株，Sheng州74株。州。萎病菌是6个地区的主要致病性镰刀菌，在合肥，蚌埠市，淮北市，富阳市，Chen州市和苏州市的分离频率为51.25％，45.68％，43.24。％，78.13％，74.39％和64.86％。二种是禾本科镰刀菌，其在合肥，蚌埠，淮北，富阳，Sheng州和苏州的隔离频率分别为17.50％，14.81％，18.92％，21.88％，23， 17％和32.43％。阜阳外，镰刀菌基质已从其他五个地区分离出来，主要分布在合肥，蚌埠和淮北。孢镰刀菌仅从合肥，蚌埠和淮北分离，而镰刀菌黄仅从合肥分离（表2）。上所述，假镰孢和禾谷镰刀菌是镰刀菌的主要病原体。花耳腐病的病原菌很多，其中镰刀菌是耳腐病的主要病原菌。界上大部分地区的桂花。美国，加拿大，阿根廷和巴西的桂花产区，耳腐的主要病原体是镰刀菌[13-15]。中国大部分地区，例如重庆，辽宁，甘肃，山西和陕西，桂花腐烂的主要病原体是镰刀菌[1-4]。究结果表明，在安徽省6个地区采集的桂花样品中，镰刀菌分离率最高，是桂花骨腐烂的主要病原体。安徽省。安徽桂花耳腐病标本中分离鉴定455株枯萎病菌，结果分离到假黄萎病菌的频率为59。是中国桂花最重要的病原体，占12％。与中国大部分地区的鉴定结果是一致的，并且一些研究表明，在中国东北和华北地区，轮叶褐藻的分离频率也更高[1]。中国西北的甘肃省，桂花腐烂的主要病原体是黄萎病菌和黄枯病菌[16]。西南地区的重庆，黄萎病菌，片状镰刀菌和禾谷镰刀菌是镰刀菌的主要病原体[2]。地镰刀菌的隔离频率存在差异，这与气候条件密切相关。些研究表明，干燥温暖的环境有利于镰刀菌假顶点和海带镰刀菌的感染[17-18]。据中国气象网安徽站的数据，2017年安徽省夏季高温持续时间较长，这可能是镰刀菌发生频率较高的原因之一。外，枯萎病黄萎病菌具有多种传播途径，包括通过种子运输，这使其广泛分布在各个地方[19]。花腐烂一直是桂花的重要病害。过对安徽省主要桂花产区的耳腐病标本进行分离鉴定，确定了该病的主要病原菌。徽省的桂花腐烂病是镰刀菌。防和治疗疾病非常重要。
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